Таблица 1. Программа исследований

Таблица 1.

Программа исследований

Качественные показатели и количество самок исследованных животных.

Идентификация форменных клеток крови осуществлялась по атласам Н.Т. Ивановой (1984), В.Н. Никитина (1949), Г.И. Козинца (1998, 2004), С.Л. Козинца и др. (2006), Р.П. Самусева и др.(2004), изменения форменных элементов – согласно рекомендациям Л.Д. Житеневой (1989), О.Н. Давыдова (2006). Мазки крови окрашивались по Романовского-Гимза, гематоксилин-эозином (Волкова О.В., Елецкий Ю.К., 1982). Проводили измерение и подсчет клеток крови исследуемых животных (воблы, озерной лягушки, прыткой ящерицы). Подсчет форменных элементов как красной, так и белой крови проводили методом четырех полей, т.е. более 500 эритроцитов и 200 лейкоцитов в мазке (Житенева Л.Д, 1989; Иванова Н.Т, 1984).

Гистологические и гистохимические методы. Материал обрабатывался методами классической гистологии (Пирс Э., 1962; Ромейс Б., 1954; Волкова О.В., Елецкий Ю.К., 1989). Ткани органов были фиксированы в 10%-ом нейтральном формалине, 96% этиловом спирте, жидкостях Буэна, Сера, Карнуа. Далее материал заливали в парафин, срезы изготовляли на микротоме. Гистологические срезы окрашивались гематоксилин-эозином; азур II-эозином; по методу Маллори; метиловым зелёным – пиронином по Браше. Микроскопирование фиксированных и окрашенных препаратов, осуществлялось с помощью светового микроскопа «OLYMPUS BH-2», «МИКРОМЕД-2» с применением иммерсии. Подсчет клеточного состава форменных элементов белой и красной крови проводился отдельно в каждом кроветворном органе (Стефанов С.Б. 1974; Сапин М.П. и др., 1988; Житенева Л.Д., 1989). В-клеточные популяции лимфоцитов определяли путём выявления РНК (избирательное присоединение пиронина к РНК) (Пирс Э., 1962; Волкова О.В., Елецкий Ю.К., 1989). Микрофотосъемка производилась при помощи фотонасадки SONI DSC-W7.

Статистические методы. При обработке полученного материала использовали следующие статистические подходы и показатели: расчет относительных показателей, определение средних величин, оценка достоверности различий по критерию Стьюдента, корреляционный анализ (Плохинский И.А., 1961; Лакин Г.Ф. 1990), кластерный анализ (R. C. Tryjon, 1936; J.A. Hartigan, 1975; В.И.Боровиков, 2001).

1. 
   Клеточный состав органов кроветворения костистых рыб
   

Анализ участков головной почки, состоящих из дифференцирующихся клеток крови, показал, что среди ретикулярных клеток в ней пролиферируют и дифференцируются клетки красной и белой крови. Клетки крови располагались диффузно или в виде небольших групп (до 5 клеток). Содержание клеток грануло - и агранулоцитопоэтического рядов несколько превосходило содержание формирующихся клеток эритроидного ряда, составляя, в среднем 58,06% и 41,94% - соответственно.

Было отмечено небольшое количество гемоцитобластов, их удельный вес составлял 1,3%. От числа всех клеток эритроидного ряда на бластные клетки, а именно на эритробласты приходилось 34,2%. Созревающие клетки эритроидного ряда составляли 42,5%, а зрелые эритроциты – 22,3%.

В головной почке воблы дифференцировались все лейкоциты. Количество дифференцирующихся гранулоцитов (52,2%) несколько превышало формирующиеся агранулоциты (47,8%). Из клеток гранулоцитопоэтического ряда были выявлены клетки всех стадий созревания. Из бластных клеток были отмечены миелобласты, их удельный вес составлял 2,3%. Самой многочисленной группой, из созревающих клеток, были эозинофильные метамиелоциты (12,3%). Из зрелых гранулоцитов больше всего было отмечено сегментоядерных эозинофилов – 15,5%.

Из формирующихся агранулоцитов монобласты составляли – 0,2%, лимфобласты – 4,3%, плазмобласты – 7,1%. Из созревающих клеток были отмечены пролимфоциты (8,7%) и проплазмоциты (1,9%). Зрелых лимфоцитов было выявлено больше всего – 17,5%, плазмоциты составили 8,0% .

Таким образом, анализ строения и функций головной почки воблы показал, что пронефрос рыб является многофункциональным органом, в нем происходит физиологическая регенерация эритроцитов и лейкоцитов. Кроме того, почка является еще и органом иммунологической защиты организма.

Сравнение гемопоэтической ткани головной почки осетровых рыб с гемопоэтической тканью представителя костистых рыб - воблы, показало, что у половозрелых рыб этих семейств в головной почке происходит формирование клеток эритро -, грануло - и агранулоцитопоэтического рядов. У всех рыб количество развивающихся лейкоцитов незначительно превосходило количество эритроцитов. Отмечены различия в процентном соотношении этих клеток внутри рядов. У воблы количество формирующихся эритробластов (34,2%) было на 8,2-9,2% выше, чем у осетровых рыб (Р<0,001). Из числа формирующихся эритроцитов у осетровых наибольший процент составляли зрелые эритроциты (от 37,0% - у севрюги до 39,0% -у стерляди), это на 14,7-16,7% больше, чем у воблы (Р<0,001). Среди клеток белой крови у осетровых количество формирующихся гранулоцитов (от 91,0% - у стерляди до 94,0% - у севрюги) в головной почке значительно превышало аналогичные показатели воблы (Р<0,001). Следовательно, среди формирующихся лейкоцитов у воблы количество гранулоцитов и агранулоцитов отличалось незначительно, у осетровых основная масса формирующихся лейкоцитов была представлена гранулоцитами.

Туловищная почка как кроветворный орган

Анализ клеток межканальцевой ткани туловищной почки показал, что среди ретикулярных клеток в ней пролиферируют и дифференцируются клетки эритропоэтического, грануло - и агранулоцитопоэтического рядов. Формирующиеся клетки крови располагались, в основном, диффузно или в виде небольших групп, в среднем, по 5,0±0,31 клеток. Было выявлено сравнительно небольшое количество гемоцитобластов, их удельный вес составлял - 1,3 %. Процент содержания клеток грануло - и агранулоцитопоэтического ряда был выше, чем клеток эритроидного, составляя - 60,7% и - 39,2% - соответственно.

От общего количества клеток эритропоэтического ряда эритробласты составляли - 27,5%. Наибольший процент из всех обнаруженных клеток этого ряда был у созревающих клеток (35,6%). Зрелые эритроциты составляли – 35,6%.

В туловищной почке исследованных рыб происходила дифференцировка всех видов лейкоцитов. Количество дифференцирующихся гранулоцитов (56,7%) несколько превышало количество агранулоцитов (43,3%). Из бластных были отмечены миелобласты (1,6%). Палочкоядерные эозинофилы были самой многочисленной группой из всех клеток гранулоцитопоэтического ряда (19,5%). Из зрелых гранулоцитов были отмечены нейтрофилы и эозинофилы, среди них превалировали сегментоядерные эозинофилы (4,1%).

Из формирующихся агранулоцитов бластные клетки составляли - 9,9 %; созревающие клетки – 13,7%, зрелые клетки – 20,2%. Среди бластных агранулоцитов, на монобласты приходилось – 0,5%, на лимфобласты – 3,7%, больше всего было отмечено плазмобластов – 4,6%. Среди созревающих клеток самой малочисленной группой клеток были промоноциты – 0,3%.

Таким образом, туловищные почки рыб являются универсальным органом кроветворения рыб. В них происходит дифференцировка, пролиферация и созревание клеток эритропоэтического, грануло- и агранулоцитопоэтического рядов.

В туловищной почке также, как и в головной у вобл и осетровых, формировались клетки тех же рядов. Процент формирующихся эритроцитов и лейкоцитов отличался незначительно. Отмечено, что у вобл среди формирующихся эритроцитов, удельный вес бластных клеток был выше – 27,5%, в отличие от осетровых (от 9,0 % - у осетра до 10,0% - у севрюги) (Р<0,001). Формирующихся клеток гранулоцитопоэтического ряда у осетровых рыб было больше на 38,3-40,3%, чем у воблы (56,7%) (Р<0,001), т.е. у осетровых рыб среди лейкоцитов значительно превалировали развивающиеся гранулоциты, у воблы разница между развивающимися клетками грануло- и агранулоцитопоэтического рядов была незначительна.

Морфофункциональные особенности селезенки

В участках белой пульпы, которая на срезе занимала 23,0%, среди ретикулярных клеток были обнаружены дифференцирующиеся клетки крови как красной, так и белой крови, причем, эти клетки распределялись хаотично, без какой-либо упорядоченности. В результате процесса кроветворения в белой пульпе формировались клетки эритропоэтического (37,4%), гранулоцитопоэтического (20,2%), агранулоцитопоэтического (41,9%) и тромбоцитопоэтического (0,5%) рядов.

Гемоцитобласты составляли 1,0%. Эритробласты составляли 10,9%. Зрелые эритроциты были самой многочисленной группой и составляли – 65,3%.

Из клеток гранулоцитопоэтического ряда были выявлены бластные, созревающие и зрелые клетки. Миелобластов было отмечено 2,3%. Среди зрелых клеток меньше всего было отмечено базофилов (1,5%). Нейтрофилы тоже были немногочисленной группой: из них на палочкоядерные приходилось – 0,8%, на сегментоядерные – 2,3%. Эозинофилы были самой многочисленной группой из всех клеток гранулоцитопоэтического ряда: удельный вес палочкоядерных эозинофилов, в среднем, составлял 6,8%, а сегментоядерных – 5,3%.

Из формирующихся агранулоцитов также были отмечены клетки всех стадий зрелости. Среди бластных агранулоцитов на монобласты приходилось – 0,8%, на лимфобласты – 11,3%, на плазмобласты – 3,0%. Среди созревающих клеток были отмечены пролимфоциты – 12,8% проплазмоциты – 3,0%. Из зрелых клеток меньше всего приходилось на моноциты – 0,8%, на втором месте по количеству были плазмоциты – 2,1%, и самой многочисленной группой клеток были лимфоциты – 33,6%.

Таким образом, в селезенке исследованных рыб происходит процесс кроветворения, в результате которого образуются клетки эритропоэтического, гранулоцитопоэтического, агранулоцитопоэтического и тромбоцитопоэтического рядов, кроме того, здесь накапливаются и разрушаются клетки крови.

Так, сравнивая полученные данные по кроветворной функции селезенки у воблы (представителя костистых рыб) с ранее полученными данными по кроветворению у осетровых (костно-хрящевыми), было установлено, что строение этого органа у исследованных рыб отличается: у осетровых строма селезенки визуально имела четкое подразделение на белую и красную пульпы, у воблы это разделение прослеживалось нечетко. У представителей обоих семейств (отрядов) в этом органе формировались все форменные элементы, в том числе и тромбоциты. У воблы превалировали клетки грануло- и агранулоцитопоэтического рядов (62,1%) (Р<0,001), у осетровых рыб - превалировали клетки эритропоэтического ряда (52,0-68,0%) (Р<0,001). Клетки тромбоцитопоэтического ряда у осетровых (2,0-6,5%) составляли больший процент, чем у вобл (0,5%) (Р<0,001). Среди лейкоцитов, у вобл превалировали клетки агранулоцитопоэтического ряда (67,4%) (Р<0,001), у осетровых - гранулоцитопоэтического (76,0-90,0%) (Р<0,001).

Следовательно, селезенка является универсальным органом кроветворения как у костистых, так и у костно-хрящевых рыб, но в селезенке костистых рыб стало заметным превалирование размножения лейкоцитов.

У исследованных видов этот орган парный, представл собой оформленный орган в виде небольшого треугольного утолщения, располагающегося поверхностно по медиальной стенке жаберной полости.

Со стороны жаберной полости орган покрыт однослойным призматическим эпителием. Ниже, расположен соединительнотканный слой, содержащий жировые клетки. Отмечено нечеткое разделение органа на темные участки или корковую зону и светлые участки или мозговую зону. Соотношение площадей этих зон составляло 1:2. Основными клетками тимуса являлись ретикулоэпителиальные клетки. В органе отмечены эпителиальные слоистые тельца Гассаля, которые, преимущественно, были выявлены в мозговом веществе органа. Количество лимфоцитов в мозговом веществе, по сравнению с корковым, было значительно меньшим. Среди них на зрелые лимфоциты приходилось 82,2%, на пролимфоциты - 10,7%, на лимфобласты – 4,6%. Здесь же изредка встречались проплазмоциты (0,5%) и плазмоциты (1%).

В корковом веществе клеток лимфоцитопоэтического ряда было обнаружено значительно больше, этим и обусловлен более темный цвет этого слоя: из них на зрелые лимфоциты приходилось – 54,7%, т.е. удельный вес этих клеток снизился на 27,5%, по сравнению с мозговым веществом (Р<0,001). Удельный вес пролимфоцитов (24,5%) и лимфобластов (7,0%) в корковом веществе был выше, чем в мозговом веществе (Р<0,001). Плазматических клеток здесь было отмечено больше, чем в мозговом веществе (Р<0,001).

У осетровых (Ложниченко О.В., 2007) и костистых рыб тимус являлся парным органом, который находился за глоткой на медиальной стороне жаберной крышки. По сведениям О.В. Ложниченко (2007), тимус осетровых рыб подразделялся на дольки, где хорошо было различимо корковое и мозговое вещество, корковое вещество по объему доминировало. В нем у осетровых происходило формирование лимфоцитов и эозинофилов, хотя доля клеток гранулоцитопоэтического ряда была незначительной (0,7-0,9%). В отличие от осетровых, тимус воблы не подразделялся на дольки, строма органа четко делилась на корковое и мозговое вещество, в соотношении 1:2. Из формирующихся клеток крови у вобл в тимусе были обнаружены только лимфоциты, что указывало на следующую закономерность: выделение лимфоидных органов из универсальных кроветворных органов происходит постепенно, первым лимфоидным органом становится тимус. Такая специализация тимуса происходит у костистых рыб.

Особенности кроветворения в пищеварительном тракте

У особей, подвергнутых анализу, в собственной пластинке слизистой оболочки кишки были отмечены различные клеточные элементы: фибробласты, лимфоциты, плазматические клетки, эозинофилы, нейтрофилы и макрофаги. Кроме того, здесь были выявлены небольшие одиночные скопления кроветворной ткани, форма этих скоплений была различной: от вытянутой до округлой. Они встречались на всем протяжении пищеварительного тракта. Нередко было отмечено, что лимфоидные скопления плотно прилегали к эпителиальному слою слизистой оболочки кишечника. По мере приближения к заднему отделу кишечной трубки количество лимфоидных скоплений увеличивалось. Клеточный состав кроветворных образований переднего, среднего и заднего отделов незначительно отличался и был представлен клетками гранулоцитопоэтического (9,6%, 11,4%, 5,0% - соответственно) и агранулоцитопоэтического (90,4; 88,6%; 95,5% - соответственно) рядов.

Во всех отделах кишечной трубки у исследованных особей, в большей степени в центре скоплений кроветворной ткани, были выявлены гемоцитобласты, хотя их было незначительное количество. Остальные формирующиеся клетки во всех отделах диффузно распределялись между активными ретикулярными клеткам. В гемопоэтических образованиях кишечника воблы были выявлены формирующиеся агранулоциты - лимфоциты, в том числе плазмоциты и гранулоциты.

Удельный вес лимфобластов от числа всех развивающихся клеток лимфоцитопоэтического ряда составлял в переднем отделе пищеварительного тракта – 10,2%, в среднем их количество было на 3,4±0,12% меньше, чем в переднем отделе (Р<0,001), и в заднем отделе этих клеток было выявлено меньше всего – 5,9% (Р<0,001). Отмечена тенденция объединения этих клеток в группы по 2-3 шт. Пролимфоциты были разбросаны диффузно. Удельный вес пролимфоцитов в переднем отделе кишечника составлял -10,0%, в среднем кишечнике их количество несколько уменьшилось, по сравнению с передним отделом, составляя – 9,6% (разница не достоверна), в заднем отделе их оказалось меньше всего – 5,8% (Р<0,001). Лимфоциты были рассредоточены почти равномерно по всему кроветворному образованию. Эти клетки были самой многочисленной группой. Их процентное соотношение в краниально-каудальном направлении несколько увеличивалось. Следует обратить внимание на то, что процесс дифференцировки унипотентных клеток предшественниц приводил к образованию плазмобластов, затем проплазмоцитов и, наконец, плазмоцитов. Эти клетки располагались диффузно по всем кроветворным образованиям. Удельный вес плазмобластов от числа развивающихся клеток был равен в переднем отделе пищеварительного тракта – 5,1%, в среднем – 6,8% (Р<0,001) и в заднем отделе их количество понизилось на 2,5%, в сравнении со средним отделом (Р<0,001). Кроме того, в кроветворных образованиях пищеварительного тракта было отмечено небольшое количество формирующихся гранулоцитов. Миелобласты встречались только в переднем отделе кишечника, составляя – 1,0%; промиелоциты – в переднем (2,3%) и среднем (0,9%) отделах (Р<0,001). Миелоциты нейтрофильные в переднем отделе пищеварительного тракта составляли – 1,1%, в среднем – 0,9% (различия не достоверны). Метамиелоциты нейтрофильные встречались во всех отделах и составляли – 2,5%; 4,1% (Р<0,001); 0,8% (Р<0,001) - соответственно.

Кроветворные образования пищеварительной системы сравниваемых представителей костистых и костно-хрящевых рыб отличались как по строению, так и по клеточному составу. У осетровых рыб гемопоэтические образования пилорической железы, среднего кишечника и спирального клапана имели различные размеры: от мелких до крупных, были заключены в плотную соединительнотканную капсулу. Наибольшие отличия по количественному составу дифференцирующихся клеток у сравниваемых рыб были выявлены в переднем отделе пищеварительного канала (Р<0,001). У обеих групп рыб в гемопоэтической ткани формировались агранулоциты и гранулоциты.

Кроветворная функция сердца

Внутри перикарда, на уровне нижнего края желудочка были обнаружены относительно небольшие кроветворные очаги, различные по форме, которые содержали сравнительно небольшое количество развивающихся клеток крови. Основу этих очагов составляли ретикулярные клетки, среди которых были диффузно расположены развивающиеся клетки крови.

В кроветворных образованиях сердца были отмечены клетки гранулоцитопоэтического, агранулоцитопоэтического и эритропоэтического рядов. Причем, клетки эритропоэтического ряда составляли 36,36%; 63,64% - приходилось на клетки грануло - и агранулоцитопоэтического рядов, из них гранулоциты составили – 45,45%, агранулоциты – 18,19%.

Из клеток эритропоэтического ряда встречались эритробласты (22,3%), проэритробласты (27,76 %), оксифильные эритроциты (21,9%) и зрелые эритроциты (28,04%), т.е. половина из них уже содержала гемоглобин. Из числа агранулоцитов были выявлены лимфоциты (12,6 %) и пролимфоциты (16,0%), клеток моноцитарного ряда не было обнаружено. Из клеток гранулоцитопоэтического здесь развивались миелобласты (10,0%), промиелоциты (18,6%), миелоциты (5,21%), метамиелоциты эозинофильные –28,5% и эозинофилы палочкоядерные – 9,09%.

При сравнении строения кроветворного образования перикарда у воблы и у осетровых рыб, были выявлены отличия. У осетровых на вентральном листке перикарда было обнаружено образование, усеянное бугорками - фолликулярными узелками овальной формы, заключенными в тонкую соединительнотканную капсулу. Внутри узелок был разделен соединительнотканными перегородками на лопасти, где ретикулярная ткань концентрировалась по периферии. У воблы, в отличие от осетровых рыб, кроветворные узелки в перикарде представляли собой небольшие скопления развивавшихся клеток крови, находившихся среди ретикулоцитов. Но у тех и у других видов рыб в перикарде образовывались клетки гранулоцитопоэтического, агранулоцитопоэтического и эритропоэтического рядов. У осетровых рыб, на примере русского осетра, формирующиеся лейкоциты составляли больший процент (85,0%), в сравнении с воблой (Р<0,001). Формирующихся эритроцитов, наоборот, больше было у воблы (Р<0,001). Среди формирующихся клеток эритропоэтического ряда, у осетровых рыб, процент бластных клеток (34,2%) был выше:, чем у воблы на 11,9% (Р<0,001). Таким образом, в кроветворной ткани расположенной в полости перикарда, формировались все форменные элементы, кроме тромбоцитов и моноцитов.