МөЖ. Белковая комплементация как инструмент для изучения межбелковых взаимодействий в живой клетке
АҚУЫЗДАРДЫ ҚОСЫМША РЕПОРТЕРЛІК ЖҮЙЕЛЕР АРҚЫЛЫ СКРИНИНГ
жүктеу/скачать 1.5 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Мысал ретінде
| АҚУЫЗДАРДЫ ҚОСЫМША РЕПОРТЕРЛІК ЖҮЙЕЛЕР АРҚЫЛЫ СКРИНИНГ
Комплементацияға негізделген репортерлік жүйелер екі ақуыздың өзара әрекеттесуін зерттеу үшін ғана емес, сонымен қатар серіктестердің ақуыздарын анықтау үшін де қолданылады. Осы мақсатта сплит ферментінің активтенуі уларға төзімділікке ие болатын жүйелер қолданылады. Мысал ретінде наубайхананың ашытқы жасушаларында скрининг жасау үшін қолданылатын сплит DHFR негізіндегі репортер жүйесін ). De novo ашытқы жасушаларында нуклеотид синтезі үшін қажет DHFR метотрексатпен ингибирленеді, ал репортер жүйесінде метотрексатқа сезімтал емес мутантты ферменттің фрагменттері қолданылады. Бұл фрагменттер зерттелетін ақуыздармен байланысады және егер ақуыздар өзара әрекеттессе, онда "жұмыс істейтін" DHFR пайда болады, бұл жасушаны метотрексатқа төзімді етеді а-CRE сплитрекомбиназасын белсендіру механизмі. Лиганд болмаған кезде (4 гидрокситамоксифен, 4oht) эстроген мутантты рецепторлары (ERT) CRE фрагменттерін цитоплазмада жылу шок ақуыздарында (HSP) бекітеді. 4oht қосу ERT-ді HSP кешенінен босатады және CRE фрагменттерін толықтыруға және ядроға өтуге мүмкіндік береді. B-TEV сплит протеазасының мысалын қолдана отырып, протеазалық репортердің активтенуін тіркеудің нұсқалары: А және В ақуыздарының қайта қосылуы TEV фрагменттерінің комплементациясына әкеледі. 1 - Протеаза люциферазаның N - фрагментіне (1 - спиральға қосылған) немесе С-фрагментке (2-спиральға қосылған) қосылған екі қосымша α-спиральды байланыстыратын бөлімдерді бөледі. Бұл спиральдар сұр түстің әртүрлі реңктерімен ерекшеленеді. а-CRE сплитрекомбиназасын белсендіру механизмі. Байланыстырушы аймақты бөлгеннен кейін әртүрлі кешендерге кіретін 1 және 2 спиральдар рекомбинациялануы мүмкін, бұл белсенді люциферазаның пайда болуына әкеледі. 2-Протеаза транскрипция факторын (TF) мембранада орналасқан ақуызбен байланыстыратын ақуыз тізбегін бұзады. Бос транскрипция факторы ядроға өтіп, репортер генінің транскрипциясын белсендіре алады. жүктеу/скачать 1.5 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|