Мусабеков айдос туменбаевич

1. 
   Глюкоза медицинская по ГОСТу 6038-51 (С₆Н₁₂О₆ · Н₂О), относительная молекулярная масса 198,7 - 45,0 г.
   
2. 
   Натрия цитрат трехзамещенный по ГОСТу 3161-57 (Nа₃Н₆Н₅О₇ · Н₂О), относительная молекулярная масса 357,16 - 4,15 г.
   
3. 
   Натрий двууглекислый по ГОСТу 4201-66 (NаНСО₃), относительная молекулярная масса 84,01 - 0,75 г.
   
4. 
   Калия цитрат двухзамещенный по ГОСТу 9190-59 (С₆Н₆О₇К₂), относительная молекулярная масса 388,644 - 2,50 г.
   
5. 
   Дитиотреитол (1,4димеркапто-2,3-диоксибутан) по ТУШЗ 45-65–0,15 г.
   
6. 
   Унитиол (2,3-димеркаптопропансульфонат натрия) по ТУШЗ 44-65 (СН₂(SН)СН(SН)СН₂SО₃Nа · Н₂О) относительная молекулярная масса 210,278 - 0,27 г.
   
7. 
   «Спермосан-3» - 6,0 г.
   
8. 
   Вода дистиллированная – 1000 мл.
   

По сравнению с существующими аналогами, новая разработанная среда способствует удлинение жизнеспособности сперматозоидов хряков. Разработанная новая среда увеличила абсолютный показатель живучести сперматозоидов хряков на 43,4% по сравнению со средой глюкозо-хелато-цитратным (ГХС) средой и на 34,7% со средой ГХЦС-8.

Проведенные эксперименты с новой средой ГЦДУ по изучено влияния выдержки в темноте перед разбавлением, при температуре +18 ⁰С. Установлено, что в процессе дальнейшего хранения выдержка половых клеток хряков перед разбавлением со средой ГЦДУ в темноте, улучшает сохраность акросом сперматозоидов и их подвижности (табл.21и рис. 4).В качестве

контроля взята переживаемость сперматозоидов при ее разбавлении сразу после получения.

Из таблицы 21 видно, что наивысший абсолютный показатель живучести сперматозоидов (144%) получена при выдержке спермы перед разбавлением средой ГЦДУ в течение 40 минут.

В опытах по изучению темпа разбавления спермы проводили в нескольких вариантах: среду приливали к сперме мгновенно, а также порциями в течение 2; 3 и 4 минут. Установлено, что если температура и осмотическое давление среды и спермы строго одинаковы, замедленное разбавление не имеет преимуществ перед мгновенным. Однако даже при небольших различиях в температуре или осмотическом давлении замедленное разбавление обеспечивало более высокий абсолютный показатель живучести половых клеток хряков.

Изучено также влияние степени разбавления спермы средой ГЦДУ на абсолютную живучесть гамет хряков (табл. 22). Наиболее высокий абсолютный показатель живучести половых клеток, обнаружена при разбавлении спермы в соотношениях от 1:0,5 до 1:4. Такие степени разбавления эякулятов получила наибольшее распространено в практике искусственного осеменения свиней.

Установлено, что наиболее оптимальными степенями разбавления спермы хряков средой ГЦДУ явлются от 1:1 до1:3. в этом промежутке половые клетки хряков показывают лучшие активности и живучести. Поэтому и рекомендуем при использовании среды ГЦДУ в зависмости от концентрации сперматозоидов эякуляте лучше придерживатся степень разбавление 1:2.

Именно такой степень разбавление показал высший результат (+5%) по сохранению жизнеспособности половых клеток хряков.

Исследованиями установлено, таблица 23, что температура +18 ⁰С обеспечивает наиболее высокую переживаемость спермы хряков-производителей и поэтому нами рекомендуется хранить разбабленной с ГЦДУ в этой температуре.

Главным показателем сперматозоидов являются оплодотворяющая способность яйцеклеток самок. Поэтому нами проведены исследования по сохранность оплодотворяющей способности сперматозоидов хряков, храненной в новой среде и качество полученного потомства.

В таблице 24 приведены результаты опыта по изучению оплодотворяющей способности сперматозоидов, сохраненных в средах ГЦДУ и ГХЦС-8. Из таблицы 24 видно, что оплодотворяемость свиноматок, осемененных спермой сохраняемой в среде ГЦДУ, значительно выше, чем при использовании среды аналога ГХЦС-8. Установлено, что в новой среде ГЦДУ оплодотворяющая способность сперматозоидов сохраняются три (75,0-91,6%) более суток, а в широко используемой среде ГХЦС-8 двое суток.

Такие разницы по сохранности оплодотворяющей способности сперматозоидов позволит на одну треть сократить поголовья хряков-производителей, сэкономить корма на 30-33% и использовать освободившие помещения для содержания свиноматок и получать дополнительную продукцию, для искусственного осеменения использовать только высокоценных, проверенных по качеству потомства производителей.

Рисунок 5- Установление диапозона температур для хранения спермы хряков в среде ГЦДУ
Таким образом, разработанная новая среда по сравнению с существующими аналогами имеет следующие основные преимущества:

- введенные в состав разбавителя унитиола и дитиотреитола позволяет защитить от окисления структурных сульфгидрильных групп сперматозоидов, а также тиоловых ферментов плазмы и половых клеток (особенно группы дегидрогеназ). В результате чего сохраняются структурные элементы половых клеток, что в свою очередь способствуют увеличение жизнеспособности гамет самцов. Сохранение активности ферментов групп дегидрогеназ обеспечивают нормального протекания обмен веществ сперматозоидов.

- вновь введенные тиоловые соединения способствуют более продолжительный период целостность акросом гамет в условиях in vitro и тем самым способствуют продолжительность времени сохранения оплодотворяющей способности сперматозоидов;

Таблица 24- Результаты осеменения свиноматок спермой храненных в средах ГЦДУ и ГХЦС-8

- вновь введенные тиоловые реагенты стабилизирует процессы окислительного фосфорилирования спрематозоидов;

- увеличение срока сохранности оплодотворяющей способности сперматозоидов (до 5 суток) позволит на одну треть сократить поголовья хряков-производителей, сэкономить корма на 30-33% и использовать освободившие помещения для содержания свиноматок, получать от них дополнительную продукцию, а также для искусственного осеменения использовать только высокоценных, проверенных по качеству потомства производителей (рис. 6).

Таким образом, в современных условиях ведения свиноводства страны наиболее выгодно и удобно применение метода искусственного осеменения свиноматок и в качетстве разбавителя спермы хряков использовать новой разработанной для спермы хряков глюкозо-цитрато-дитиотреитоло-унитиоловой среды. Применение метода искусственного осеменения свиноматок и новой среды для разбавления спермы хряков позволит использовать только высокоценных, проверенных по качеству потомства производителей. экономного использования кормов и помещения для содержания животных.

Рисунок 6- Основные преимущества нового разбавителя спермы хряков ГЦДУ по сранению существующими аналогами

Качество спермы хряков, ее способность к длительному хранению, а, следовательно, оплодотворяемость и многоплодие свиноматок зависят не только от биологических особенностей спермы, но и от технологии ее получения. Основными показателями качества спермы на промышленных комплексах являются три основных показателя: подвижность (балл), объем (мл) и концентрация (млн/мл).

В настоящее время в крупных свиноводческих хозяйствах страны вместо ранее широко использовавшегося метода получения спермы на искусственную вагину все чаще используется мануальный. Метод более прост в применении, при его использовании не требуется предварительной подготовки вагины и поддержания ее температурных условий.

По данным литературы, от хряков получают эякуляты, имеющие средний объем 250 мл с концентрацией сперматозоидов 0,2 млрд\мл и активностью 8 баллов. В эякуляте должно содержаться 40 млрд поступательно-подвижных сперматозоидов.

Целью наших исследований на этом этапе являлось изучение количественных и качественных показателей спермы, получаемой мануально от хряков датской селекции различных пород, а также их сравнение с показателями диализированной спермы этих же хряков, чтобы последующей криоконсервации спермы использовать данный метод.

Приведенные данные в таблице 25 свидетельствуют о том, что хряки, выращенные в условиях датской фермы до 6-месячного возраста, имеют сперму с высокой концентрацией, но низкой подвижностью. Следует отметить, что самые низкие показатели активности сперматозоидов оказались у хряков породы ландрас. Из имеющихся трех ландрасов один оказался крипторхом и использовался только в качестве пробника. Невысокие показатели подвижности сперматозоидов у хряков породы дюрок компенсировались хорошими показателями переживаемости спермы.

При анализе спермопродукции хряков датской селекции установлено, что у хряков пород дюрок и ГД объем эякулята меньше средних в сравнении с литературными данными. Однако подвижность сперматозоидов у хряков гемпшир+дюрок (ГД) близка к норме. При объеме эякулята 168,75 и содержании в нем поступательно-подвижных сперматозоидов 50,83 млрд активность сперматозоидов составляла 7,2 балла. Самые низкие показатели активности у хряков породы ландрас - 4,9 баллов. Объем эякулята в пределах физиологической нормы имели хряки пород ландрас и йокширская. По концентрации сперматозоидов лучшие показатели имели хряки породы ландрас, при этом и объем эякулята был на уровне среднего.

При проведении анализа качества спермопродукции нам удалось установить, что у всех хряков концентрация сперматозоидов была выше средних показателей, полученных другими исследователями. Высокая концентрация сперматозоидов в эякуляте исследуемых хряков обусловлена способом получения спермы – мануальным (первая фракция и часть третьей для оценки и разбавления не использовалась). Известно, что третья фракция составляет 51% жидкой части эякулята (без секрета Куперовых желез), т.е. имеет наибольший объем и относительно небольшую концентрацию сперматозоидов.

Вероятно, на низкие показатели подвижности сперматозоидов повлияла именно высокая концентрация сперматозоидов в эякуляте, т.к. самые высокие показатели концентрации сперматозоидов и общее количество сперматозоидов в эякуляте имели хряки породы ландрас и дюрок, при этом у них же самые низкие показатели подвижности.

Для осеменения свиноматок применялась сперма с активностью не ниже 6 баллов. Сперма с активностью ниже 6 баллов выбраковывалась. Однако при более детальном исследовании показателей спермы оказалось, что сперма с хорошей подвижностью имеет значительное количество патологических форм сперматозоидов, которые, естественно, снижают ее оплодотворяющую способность.
Таблица 26- Морфологические и физиологические показатели спермы хряков

В девяностые годы активно разрабатывался метод криоконсервации спермы, основанный на диализе [102]. Авторами были разработаны различные диализные камеры и среды, предназначенные для использования подготовки спермы хряков к процессу криоконсервации. Однако из-за трудоемкости процесса и нестабильности результатов криоконсервация спермы хряков не получила широкого распространения. Однако сохранение спермы хряков при комнатной температуре на свиноводческих комплексов по-прежнему актуально.

Нами проведена сравнительная характеристика спермы сохраняемой при комнатной температуре с использованием диализной камеры и диализной среды (ГХЦЖК) на переживаемость спермы хряков. Исследовалась сперма 2 хряков (нечетная садка использовалась в контроле, а четная – в опыте).
Таблица 27- Сравнительная характеристика спермы сохраняемой при температуре 16 ºС и с использованием метода диализа

Как видно из таблицы 27 активность сперматозоидов в опыте к контролю была выше на 1,2 балла. Однако более детальное исследование спермы показало (таблица 28), что сперматозоиды, сохраняемы при температуре +14+16 ºС имели меньше повреждений акросом – на 16,85%.

Таким образом, при анализе спермопродукции хряков датской селекции, получаемой мануальным способом, выявлено достоверное отклонение от нормы по показателям объема, концентрации и подвижности сперматозоидов. Отмечено значительное количество сперматозоидов (35,6%) с поврежденной акросомой. Использование диализной камеры при хранении спермы хряков при температуре 14-16 ºС в течение суток позволяет сохранить активность на 1,2 балла выше в сравнении с неразбавленной спермой, и меньший процент поврежденных акросом (разница составляет 16,85%).

При отборе хряков-производителей наряду с их продуктивно-племенными качествами следует обращать внимание на качество спермы, ее количество и способность к оплодотворению после длительного хранения (криоконсервации).
3.2.2 Разработка методики отбора спермы хряков для криоконсервации

Разработка методов долговременного хранения спермы хряков путем криоконсервации при сверхнизких температурах позволяет проводить углубленную племенную работу на основе создания банков спермы наиболее ценных хряков-производителей генофондных хранилищ спермы хряков исчезающих пород.

У хряков по сравнению с самцами других животных сильнее развиты придаточные половые железы, которые в момент эякуляции выделяют большое количество различного состава секретов, потому по объему хряк превосходит все другие виды сельскохозяйственных животных. Так в среднем объем эякулята составляет 250-320 мл, в отдельных случаях достигает 800-1000 мл и более.

Большой объем эякулята хряка осложняет технологию криоконсервации спермы и снижает экономическую эффективность метода, так как требуются большие затраты труда, много хладоагента, химических реагентов для среды и т.п.

Нестабильность результатов осеменении свиноматок кроиконсервированной спермой, отмечаемая многими исследователями ([199]; [205]; [210]; [211]; [220]) обусловлена значительной индивидуальной, породной, возрастной, сезонной изменчивостью устойчивости спермы к воздействию низких температур. Показатель жизнеспособности оттаянной спермы быков – подвижность и живучесть – имеют положительную корреляцию с оплодотворяющей способностью, но эти показатели оказались не приемлемы для оценки спермы хряков. Такое несоответствие связано с тем, что подвижность и выживаемость сперматозоидов характеризуют состояние энергетического и двигательного аппаратов и не отражают состояние ядра и акросомы, определяющих их оплодотворяющую способность и эмбриональное развитие зародыша.

Наши исследования показали, что акросома хряка в связи с высокой обводненностью быстрее и значительнее, чем у быков, подвергается криогенным повреждениям. Поэтому показатели подвижности и живучести после оттаивания можно использовать лишь для предварительной оценки новых технологических вариантов криоконсервации, окончательным же критерием необходимо считать оплодотворяемость и опоросы свиноматок.

Нами изучены связи основных показателей спермы хряков после воздействия холодового удара с оплодотворяющей способностью заморожено-оттаянной спермы. Во время эксперимента для нанесения холодового удара в ледяную баню помещали для предварительного охлаждения пенициллиновые флаконы, которые затем вносили по 5 мл спермы с температурой 32-37 ⁰С и выдерживали в течение 10 минут. После этого сперму нагревали до исходной температуры и по существующим правилам оценивали эякуляты (табл.29).

Анализ таблицы 29 показывают, что подвижность и время выживания заморожено-оттаянной спермы хряков имеют положительную связь с оплодотворяющей способностью оттаянной спермы (r = 0,45, r = 0,48). Поэтому оценки заморожено-оттаянной спермы хряков и прогнозирования ее оплодотворяющую способность, в определенной степени можно вести по этим тестам.

В результате исследований, как показано в таблице 30, установлены пределы показателей для отбора эякулятов на криоконсервацию заморожено-оттаянной спермы хряков – на осеменение свиноматок).

Описанные методы оценки криоустойчивости и прогнозирования оплодотворяющей способности спермы были апробированы в производственных опытах (табл. 31).

Исследовались 66 эякулятов от 6 хряков и осеменено 40 свиноматок. Фактическая оплодотворяемость свиноматок составила 38,3%.

Таким образом методика предложенная нами полностью оправдывает себя. Фактически полученная оплодотворяющая способность заморожено-оттаянной спермы совпали с теоретически ожидаемой, что подтверждает надежность отбора спермы для криоконсервации и практического использования в производственных условиях.
3.2.3 Исследование взаимосвязи показателей качества спермы с ее криоустойчивостью

С целью разработки методов отбора спермы для замораживания нами были поставлены опыты по изучению связи оплодотворяющей способности замороженно-оттаянной спермы отдельных хряков с физиологическими и биохимическими показателями свежеполученной спермы этих животных. Свежеполученные эякуляты 10 подопытных хряков были исследованы по следующим показателям – активности сперматозоидов, концентрации спермы, общей активности дегидрогеназ по времени редукции метиленовой сини, активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и глутаматоксалаттрансаминазы (ГОТ), дыханию и стимуляции дыхания янтарнокислым калием и 2,4-динитрофенолом. После оценки сперму замораживали по 8 - 10 эякулятов от каждого хряка и осеменяли свиноматок на свиноводческом хозяйстве “Достык”. Результаты наших исследований показали, что оплодотворяющая способность (ОС) замороженной спермы от хряков отобранных в опыт по зоотехническим показателям варьировала от 12,5 до 85,7%, при этом лишь у трех животных (33% от общего числа) сперма после замораживания-оттаивания сохранила оплодотворяющую способность более 50% (табл. 32)

По результатам оценки оплодотворяющей способности спермы после ее замораживания-оттаивания хряков-производителей разбили на две группы. В первую группу вошли животные с низкой оплодотворяющей способности (28%), во вторую - с высокой оплодотворяющей способности (80%). Статистические подсчеты показали, что различие между средними значениями оплодотворяющей способности этих групп достоверны. У оцениваемых хряков-производителей активность, объем и концентрация свежеполученного эякулята, будучи в пределах зоотехнической нормы и требованию «Инструкции по искусственному осеменению свиней», не имели достоверной корреляционной связи с оплодотворяющей способностью замороженно-оттаянной спермы. Только активность сперматозоидов имела небольшую достоверную связь с оплодотворяемостью. Следователно, отбор животных по основным зоотехническим показателям является малоэффективным при криоконсервации спермы хряков. Оценка активности фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сперматозоидах и плазме свежеполученной спермы показала, что нет разницы по содержанию ЛДГ в сперматозоидах из эякулятов с высокой и низкой сохранностью оплодотворяющей способности.

Следует отметить только отдельно взятый показатель активности лактатдегидрогеназы в плазме не может быть надежным критерием для оценки криоустойчивости спермы, поскольку величина разницы активности фермента между группами с высокой и низкой оплодотворяющей способностью хотя и достоверна, но очень низкий.

Таблица 33- Активность лактатдегидрогеназы в свежеполученной сперме хряков с различной оплодотворяющей способностью после криоконсервации

В то же время в плазме свежеполученной спермы содержание лактатдегидрогеназы достоверно различается (табл. 33).

При оценке активности лактатдегидрогеназы в отдельных эякулятах хряков, из-за дивидуальных, различий сперма с низкой криоустойчивостью может оказаться в группе с высокой криоустойчивостью сперматозоидов и наоборот (табл. 34).
Таблица 34- Активность лактатдегидрогеназы в свежеполученной сперме хряков-производителей

Исследования (табл.35) переживаемости свежеполученной спермы при 37С и ее устойчивости к замораживанию не выявило взаимозависимой связи между этими показателями. Достоверной разницы по времени переживания сперматозоидов в группе животных с высокой и низкой оплодотворяющей способностью не имеется. Однако скорость дыхания (Vэ) спермы с низкой устойчивостью к замораживанию (I группа) выше чем у сперматозоидов с высокой устойчивостью (II группа). Коэффициент корреляции - r= -55, P<0,05.

Наличие отрицательной связи между скоростью дыхания и устойчивостью спермы к замораживанию-оттаиванию дает основания предполагать о том, что сперматозоиды с высокой скоростью окислительных процессов менее устойчивы к охлаждению и замораживанию-оттаиванию, так как они менее лабильны к переходу к состоянию гипобиоза - необходимого условия перед замораживанием. Но использование данного теста для оценки криорезистентности спермы и отбора животных приемлем только при предварительном “грубом“ отборе животных и только в группах определенной породы, поскольку сперма животных обладает не только индивидуальной, но и породной изменчивостью интенсивности дыхания.

Кроме того приведенные выше данные исследований показали, что изменение скорости дыхания спермы возможно вследствие разобщения дыхания и фосфорилирования в результате “холодового шока” например, при получении спермы. Это может вызвать накладку ошибки при отборе животных.

Добавление сукцината к сперме животных из I-ой группы приводит к увеличению (стимуляции) скорости дыхания сперматозоидов, что, как отмечали выше, указывает на повреждение их внешней мембраны или нарушение ее проницаемости. Следовательно стимуляция дыхания сперматозоидов при добавлении сукцината более чем 1,1 раза (Vц/Vэ>1,1) является показателем низкой криоустойчивости сперматозоидов.

Более лучше характеризует устойчивость спермы к замораживанию реакция дыхания сперматозоидов в ответ на добавление динитрофенола. Как видно из таблицы 35 стимуляция дыхания с динитрофенолом сперматозоидов второй группы привело к значительному повышению дыхания, чем у сперматозоидов первой группы. Это данные показывают, что сперматозоидов с хорошим сопряженным дыханием и фосфорилированием более устойчивы к замораживанию.

Подсчеты показали, что коэффициент корреляции между величиной стимуляции дыхания динитрофенолом и оплодотворяющей способностью спермы равен +0,71 (P<0,001). Из данных таблицы 35 следует, что для сохранения оплодотворяющей спесобности сперматозоидов после замораживания-оттаивания >50% необходимо отбирать для криоконсервации свежеполученную сперму со стимуляции дыхания - VДНФ/Vэ>3,0, при стимуляции дыхания сукцинатом калия менее 1,1 раза (Vсц/Vэ<1,1).

Поскольку падение температуры спермы до субнормального уровня - “холодовой шок” - оказывает повреждающее действие на сперматозоиды. В. Кононов [81], Ф.Осташко [36], В. Наук [45] предложили использовать тетст устойчивости спермы к холодовому шоку для определения пригодности отдельных эякулятов быков-производителей к замораживанию.

Учитывая эти предложения, нами проведены исследования возможности использования теста устойчивости спермы к холодовому шоку для отбора криоустойчивого эякулята хряков. С этой целью изучали наличие связи между показателями качества сперматозоидов после “холодового шока” и оплодотворяющей способностью сперматозоидов после замораживания-оттаивания (устойчивость к замораживанию).
Таблица 35- Показатели энергетического обмена и абсолютного показателя живучести сперматозоидов свежеполученных сперматозоидов хряка с различной оплодотворяющей способностью после замораживания

В экспериментах температурный шок сперматозоидов вызывали быстрым снижением температуры от +37С до +2С. Для этого 3 мл спермы выдерживали в ледяной ванне в течение 10 мин. Подвергнутую шоку сперму оценивали по активности, абсолютный показатель живучести, времени редукции метиленовой сини, сохранности акросом и стимуляции дыхания 2,4-динитрофенолом. Результаты опытов показали, что время переживания, стимуляция дыхания 2,4-динитрофенолом, а также время редукции метиленовой сини сперматозоидов, а также процент сохранности акросом после температурного шока имеют достоверную корреляцию с оплодотворяющей способностью сперматозоидов. Установлено, что наиболее высокую корреляцию при этом имеют сохранность акросом и величина стимуляции дыхания сперматозоидов хряков. Общие суммарные результаты изучения связи показателей спермы подвергнутой холодовому шоку с ее оплодотворяющей способностью после замораживания-оттаивания показали, что показатели спермы с оплодотворяющей способностью после замораживания <50% (средняя оплодотворяющая способность 32%) отличались от показателей спермы с оплодотворяющей способностью >50% (средняя оплодотворяющая способность 78%) по активности на +18%, времени переживания на +22%, стимуляции дыхания 2,4-динитрофенолом на +33% а по времени редукции метиленовой сини на -29% и по количеству поврежденных акросом на -21% (табл. 36). Существенные различия средних значений показателей шокированной спермы в группах животных с низкой и высокой оплодотворяющей способностью спермы после замораживания свидетельствует о возможности использования этих показателей для отбора криоустойчивости сперматозоидов хряков.

Ряд исследователи A.Smith, C.Polge [6], E.Graham, B.Crabo [16], А. Варнавский, [23], В.Милованов и др. [44] считают, что потеря оплодотворяющей способности сперматозоидов хряков - это результат криогенных повреждений акросомного аппарата сперматозоидов при замораживании и оттаивании. В то же время И.Смирнов [5], A.Blackshfw, C. Salisbury [29], Е. Платов [7] считают, что она связана отсутствием оплодотворяемости при осеменении замороженной спермой связано с нарушением способности сперматозоидов к нормальному движению или с их малой выживаемостью в половых путях самки в результате повреждения структуры кинетического центра и энергетического аппарата (митохондрий) сперматозоидов под воздействием низких температур и высоких температур при оттаивания.

Поэтому при разработке метода криоконсервации спермы и поиске способов защиты сперматозоидов от повреждающего действия низких температур, очень важно знать особенности и характер наиболее типичных криогенных изменений в каждом отделе сперматозоида хряков

Сперматозоиды хряка, по сравнению с гаметами других сельскохозяйственных животных, обладают наименьшей устойчивостью к повреждающему действию низких теиператур. Поэтому, исследование природы их криогенных изменений представляется важным для поиска способов криозащиты и оценки половых клеток других видов животных. Сперматозоиды хряка, на наш взгляд, могут служить в некотором роде модельным объектом при совершенствовании методов криоконсервации, криозащиты и оценки функциональной полноценности эякулятов и у других видов сельскохозяйственных животных.

Исследованиями B.Luyet и E.Hodapp [3] было установлено, что сперматозоиды очень богаты сульфгидрильными группами. Эти группы присутствуют во многих ферментах и других белковых соединениях половых клеток, участвуют в обеспечении нормального функционирование жизненных процессов протекающих в сперматозоидах. Исследования В.Энгельгардта и Г.Яровой [167] показали, что взаимодействие сократительных белков актина и миозина зависит от присутствия в их молекулах сульфгидрильных групп.

По данным А. Ленинджер [174] сульфгидрильные группы участвуют в реакциях сопряжения окислительного фосфорилирования, а Р. Озрина, М.Кондрашова, [191] считают, что определенную роль в этом играют проницаемости мембран митохондрий.

Таким образом следует предполагать, что одной из причин повреждения клеток при криоконсервации считается окисление сульфгидрильных групп с образованием дисульфидных (-S-S-) связей, что приводит к денатурации белков клеток.

После проведения работ по выяснению количественных показателей SН-групп в сперматозоидах и плазме спермы, изучение влияния тиоловых соединений на свежеполученную сперму хряков, на следующем этапе экспериментальных работ, нами изучены изменения этих показателей у половых клеток при охлаждении (температурного шока) и замораживании-оттаивании.

Определение количества общиx сульфгидрильных групп в свежеполученной сперме от 6 хряков показало наличие в 10 млрд сперматозоидах в среднем 10,2 мкМ SH-групп и в 100 мл плазмы 2,2 мкМ при вариабельности показателя по эякулятам в пределах 6,5-14,7 мкМ/10⁹ половых клетках и 0,8-5,3 мкМ/100 мл плазме эякулята. По отдельным хрякам-производителям эти колебания выглядело следующим образом: колебания SH-группы от 9,4 до11,1 мкМ/10⁹ половых клетках и от 1,9 до 2,9 мкМ/100 мл плазме эякулята. В гаметах подвергнутых температурному шоку наблюдалось снижение количественного содержания сульфгидрильных групп в среднем на 14,9%. Наблюдаемое снижение в плазме было не достоверно (табл.37 ).
Таблица 37- Влияние холодового шока и замораживания- оттаивания на содержание сульфгидрильных групп в эякулятах хряков.

По отдельным хрякам-производителям эякуляты подвергнутого к низкотемпературному воздействию, снижение количества сульфгидрильных групп в сперматозоидах колебалось от 14,2 до 15,9%. Замораживание спермы хряков без применение криопротекторов приводило к снижению количественных показателей сульфгидрильных групп в сперматозоидах. Колебания этого показателя по эякулятам хряков составила от 32,1 до 44,9%. В среднем по всем эякулятам хряков производителей. общее снижение содержания сульфгидрильных групп составила - 39,8%.

В плазме спермы хряков также наблюдали уменьшение содержания сульфгидрильных групп в среднем на - 13,7%. По сравнению с исходным уровнем (свежее разбавленная сперма). При замораживания и оттаивания содержание сульфгидрильных групп плазмы спермы в среднем уменьшилось на - 32,8%. Следует отметить, что нами не обнаружено достоверной разницы по снижению содержания сульфгидрильных групп в эякулятах между хряками производителями.

Таким образом, устойчивость сульфгидрильных групп белков половых клеток к повреждающему действию низких температур является более консервативным признаком, не имеющим индивидуальных различий по меньшей мере внутри одной крупной белой породы свиней. Нашт данные свидетельствуют, что одной из причин повреждения клеток при криоконсервации считается окисление сульфгидрильных групп с образованием дисульфидных связей, что приводит к денатурации белков сперматозоидов хряков-производителей.

Жизнедеятельность сперматозоидов, как и большинства других клеток, тканей и целого организма может осуществляться только в довольно узком интервале условий внешней среды. Изменение условий окружающей среды всегда приводит к регуляторным изменениям реакций обмена веществ в клетках, задачей которых является приспособление живых организмов к этим изменениям. Регуляция эта обеспечивается благодаря наличию совершенной системы ферментов в каждой клетке.

Повреждающее действие тех или иных факторов на клетки в первую очередь сказывается на функционировании ферментных систем - повышением или понижением их активности на ответ внешнего раздражителя. Поэтому исследование активности ферментов спермы при низкотемпературном воздействии имеет важное значение для выяснения причины и механизмов повреждения половых клеток при их криоконсервации.

В настоящее время для довольно значительного числа ферментов установлено, что субстраты, коферменты или их аналоги оказывают защитное действие по отношению к реа­гентам на сульфгидрильные (SН-) группы, их называют тиоловыми ферментами.

По данным Ю.М. Торчинского [14] к числу тиоловых ферментов относятся сукцинатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, изоцитратдегидрогеназы, 3-фосфоглицератдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы и многие другие участвующие в важных циклах обмена веществ в клетках.

Дегидрогеназы - это группы ферментов относящихся к классу окисиредуктаз и катализирующие перенос атомов водорода (электронов) непосредственно на кислород или на промежуточный продукт обмена веществ.

В практике искусственного осеменения сельскохозяйственных животных для оценки качество спермы используют метод определения общей активности дегидрогеназ - по времени обесцвечивания метиленового синего. По данным многих авторов, имеется связь времени редукции метиленового синего половыми клетками с активностью движения и резистентностью сперматозоидов [15,16]. В связи с этим нами иссле­довано влияние холодового шока и замораживания-оттаивания на об­щую активность дегидрогеназ в сперматозоидах хряков, при температуре +37 ^оС (табл. 38).

Анализ таблицы 38 показывает, что резкое охлаждение спермы до +1 +2 °С (холодовой шок) вызывает снижение активности общих дегидрогеназ более чем в 2,5 раза, что выражается соответствующим увеличением времени редукции метиленовой сини. Аналогичное снижение актив­ности дегидрогеназ наблюдается и после замораживания-оттаивания эякулятов хряков. На первый взгляд такое снижение соответствует снижению активности спермы - количеству погибших клеток в результате холодового шока или замораживания-оттаивания. Однако, как видно из таблицы , наблюдается и резкое, более чем в два раза, снижение време­ни живучести выживших после криоконсервации сперматозоидов.

Если бы снижение актив­ности дегидрогеназ было связано, только со снижением количества вы­живших после криоконсервации половых клеток, то мы не наблюдали бы уменьшения их живучести. Следовательно, снижение общей активности дегидрогеназ может быть связано с выходом ферментов из половых клеток в окружающую среду, а так же инактивацией в результате криогенных изменений мем­бранных структур гамет хряков.

Рядом авторов [163], [170], [171] установлено, что важная роль в регуляции обменных процессов в клетках принадлежит изоферментам лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Известно, что лактатдегидрогеназы катализирует обратное окисление лактата в пируват в присутствии НАД и является, таким образом, фермен­том связующим циклов дыхание и гликолиза. Лактатдегидрогеназы присутствует в большинстве тканей животных в форме 5 изоэнзимов – ЛДГ₁; ЛДГ₂; ЛДГ₃; ЛДГ₄; ЛДГ₅. Эти изоэнзимы являются тетраметрами, состоящими из двух полипептидных цепей Н и М субъединиц.

Лактатдегидрогеназы I (ЛДГ₁) - изофермент, характеризующийся наиболь­шим отрицательным зарядом и наибольшей электрической подвиж­ностью, состоит из Н субъединиц, а лактатдегидрогеназы 5 (ЛДГ₅) - изофермент. состоящийся из М субъединиц. Остальные изоферменты представляют собой сочетание обоих - Н и М субъединиц. Соотношение между изоферментами сильно варьирует для разных тканей и видов животных, но для каждой ткани животных строго постоянная величина.

Изменение активности и особенно соотношение изоферментов лактатдегидрогеназы является показателем тех или иных из­менений в функционировании клеток и тканей животных. В тканях животных с выра­женным аэробным обменом (сердце, почки) преобладают "быстрые" изоферменты ЛДГ₁ и ЛДГ₂ , а в тканях с анаэробным обменом - "медленные" формы ЛДГ₄ и ЛДГ₅ , что связано с различной функцио­нальной ролью Н и М субъединиц, отличающихся по ферментативным свойствам и активностью.

Регуляторная роль, которая отводится изоферментам лактатдегидрогеназы, связана с поддержанием в тканях животных определенного соотношения аэробного и анаэробного обмена веществ. В частности установлено, что в регуляции соотношения аэробного и анаэробного обмена веществ при оплодотворении важную роль играют изоферменты лактатдегидрогеназы.

Исследование изоферментного спектра лактатдегидрогеназы свежеполученной спермы хряков показало наличие всех пяти изоферментов, характеризующихся различной электрофоретической по­движностью, зарядом и активностью. Изофермент ЛДГ₁ об­ладает наибольшим отрицательным зарядом и электрофоретической подвижностью (100%) по направлению к анодному заряду. Подвижность ЛДГ₅ в сторону анода не наблюдается. Наши исследования показали что, процентное соотношение изоферментов в экстракте из сперматозоидов и в плазме в определенной степени различаются (табл. 39).
Таблица 39- Соотношение изоферментов лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сперме хряков

Хотя сперматозоидам хряка более характерен аэробный гликолиз доля "аэробных" изоферментов ЛДГ₁ и ЛДГ₂ значительно мень­ше чем "анаэробных". Как видно из таблицы 40, в половых клетках и плазме нативной спермы хряков наибольшая доля количества фермента приходится на ЛДГ₄ и составляет соответственно 38,7% и 32,3%. Остальные изоферменты эякулятов хряков распределяются в следующем порядке: спер­матозоиды – ЛДГ₁ - 8,3%; ЛДГ₂ - 4,8%; ЛДГ₃ – 24,6%; ЛДГ₅ – 26,1%; плазма – ЛДГ₁ - 17,3%; ЛДГ₂ - 15,6%; ЛДГ₃ - 29,9% и ЛДГ₅ - 8,1%. Активность ЛДГ₅ в сперматозоидах значительно (более чем в 2,9 раза) превы­шает активность изофермента в плазме спермы.

Разбавление спермы хряков глюкозо-хелато-цитратно-желточно-калиевой (ГХЦЖК) средой вызывает изменения в изоферментном спектре лактатдегидрогеназы. В сперматозоидах и плазме увеличивается активность изоэнзима ЛДГ₅ за счет чего в процентном отношении активность ЛДГ₄ снижает­ся. Наблюдается возрастание и отношения изоэнзима ЛДГ₅, состоящего только из субъединиц М к изоэнзиму ЛДГ₁ состоящему из субъединиц Н, а также некоторая активация суммарной доли М субъединиц к сумме Н субъединиц в клетках. Охлаждение разбавленной спермы до +5° С в период эквилибрации вызывает выход фермента из половых клеток в плазму, в результате чего активность фермента в сперматозоидах падает при одновременном возрастании ее в плазме эякулята (табл.42). Как видно из таблицы 40, общая активность ЛДГ сперматозоидов после эквилибрации в среде ГХЦЖК оставляет: 5,13 мкМ пировиноградной кислоты на 10⁹ половых клеток или 58,0% от активности в свежее разбавленной сперме хряков. Активность в плазме эякулята фермента при этом увеличивается на 24% к исходному уровню. Еще больший выход фермента из сперматозоидов наблюдается после замораживания-оттаивания спермы хряков.
Таблица 40- Изменение общей активности лактатдегидрогеназы в сперме хряков при замораживании и оттаивании

Полученные данные в таблице 42 свидетельствуют о том. что одновременно с выходом фермента из сперматозоидов, охлаждение и замораживание-оттаивание спермы вызывает и его инактивацию фермента половых клеток. При рассматри­вании процентного соотношения изоферментов до и после заморажи­вания сперматозоидов видно, что после эквнлибрации эякулята в среде ГХЦЖК с глицерином особых изменений в процентном распределении изоферментов не происходит.

После замораживания и оттаивания, за счет сильного снижения активности изоферментов (вплоть до полной инактивации отдельных изоферментов) происходит изменение их процентного соотношения в половых клетках хряков.

Так. в сперматозоидах, замороженных в среде ГХЦЖК, активность ЛДГ₁ составляет 15% от суммарной активности всех изофер­ментов, ЛДГ₂ – почти равно нулю, ЛДГ₃ -8,5%, ЛДГ₄ -30,1% и ЛДГ₅ - 46,2%.

в среде ГХЦЖК

Таблица 42- Изменение активности изоферментов (ЛДГ) в сперматозоидах

хряков при замораживании-оттаивании в осенне-зимнем периоде

Процентное соотношение изоферментов в плазме эякулята после заморажива­ния-оттаивания также изменяется, увеличивается ЛДГ₅ - 29,8% против 13,5% в свежеразбавленной сперме хряков. Однако эти изменения в соотношении изоферментов не влияют на общее соотношение М и Н субъединиц лактатдегирогеназы спермы. Имеется только тенденция на увеличение доли "анаэробных" (М) субьединиц спермы.

Таким образом наши исследования показали, что в сперматозоидах и плазме нативной спермы хряков наибольшая доля количества лактатдегидрогеназы приходится на ЛДГ₄ и составляет соответственно 38,7% и 32,3%. Разбавление спермы средой ГХЦЖК вызывает изменения в изоферментном спектре лактатдегидрогеназы. В половых клетках и плазме эякулята увеличивается активность изоэнзима ЛДГ₅. Установлены выход фермента из половых клеток. Количество фермента в сперматозоидах после замораживания-оттаивания составило всего лишь 23,0% от исходного уровня свежеразбавленной спермы. Одновременно с выходом фермента из сперматозоидов, охлаждение и замораживание-оттаивание эякулята вызывает и его инактивацию. Эта инактивация связана с окисление сульфгидрильных групп молекулы лактатдегидрогеназы.