Синапсис и рекомбинация у млекопитающих носителей хромосомных перестроек клеточная биология, цитология, гистология 03. 03. 04

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Анализ синапсиса и рекомбинации хромосом у гомо- и гетерозиготных носителей хромосомных перестроек позволяет решить ряд актуальных проблем клеточной и эволюционной биологии.

На сегодняшний день, благодаря использованию мейотических мутантов, молекулярные механизмы синапсиса и рекомбинации достаточно хорошо изучены. Однако не до конца ясным остается то, каким образом осуществляется контроль и регуляция этих процессов, какие факторы определяют неравномерное и неслучайное распределение рекомбинационных событий вдоль хромосомы.

На молекулярном уровне положение сайтов рекомбинации определяется положением «горячих точек», активность которых зависит как от последовательности ДНК, так и от свойств хроматина . В этих точках с высокой вероятностью происходит образование двунитевых разрывов – событий, инициирующих рекомбинационный процесс.

Однако регуляция этого процесса осуществляется также на хромосомном уровне. На это указывают общие черты в распределении сайтов рекомбинации по хромосомам, обнаруженные на множестве изученных организмов. По всей вероятности, существенную роль в этой регуляции играют особенности морфологии хромосом и динамические преобразования их пространственной организации в профазе мейоза.

Использование хромосомных перестроек, меняющих морфологию хромосом и их расположение в ядре, таких как робертсоновские транслокации, парацентрические и перицентрические инверсии, в сочетании с современными методами иммунолокализации белков синаписиса и рекомбинации хромосом, позволит приблизиться к пониманию хромосомного уровня регуляции этих процессов.

Использование этого подхода представляется перспективным для анализа другой важной проблемы – роли хромосомных перестроек в эволюции кариотипов млекопитающих. Разные отряды млекопитающих, отдельные рода и виды внутри отрядов могут значительно отличаться друг от друга по количеству и типам зафиксированных хромосомных перестроек . Однако фиксация перестроек сопряжена с трудностями прохождения через мейоз у гетерозигот, поскольку они могут вызывать нарушения синапсиса и рекомбинации, приводящие к неправильной сегрегации хромосом и анеуплоидии, стерильности, инактивации транскрипции и апоптозу (Turner et. al. 2005; Баранов, Кузнецова, 2007).

Степень этих нарушений зависит от характеристик конкретной перестройки. Изменения рекомбинационного паттерна, вызванные перестройками, могут менять приспособленность их носителей. Детальное изучение синапсиса и рекомбинации хромосом у представителей разных видов млекопитающих - носителей хромосомных перестроек позволит понять, чем определяется вероятность фиксации разных типов перестроек и какую роль они играют в видообразовании и в формировании репродуктивных изолирующих барьеров.

В данной работе эффекты робертсоновских транслокаций были изучены на животных из гибридной зоны между двумя хромосомными расами обыкновенной бурозубки. Популяции данного вида отличаются значительным полиморфизмом и политипизмом по робертсоновским транслокациям с различным сочетанием хромосомных плеч . Эффекты инверсий мы исследовали на самцах и самках мышей, гомо- и гетерозиготных по парацентрической инверсии в хромосоме 1, а также самцах муйской полевки, гетерозиготных по перицентрическим полноплечевым инверсиям в хромосомах 8 и 14. Анализ синапсиса и рекомбинации хромосом у межвидовых гибридов проводился на самцах и самках гибридов между видами-близнецами серых полевок, которые различались несколькими робертсоновскими и тандемными транслокациями, перицентрическими инверсиями, образованием неоцентромер и добавочных блоков гетерохроматина . Присутствие в кариотипе гибридов нескольких перестроек разных типов позволяет оценить их кумулятивный вклад в возникновение мейотических нарушений и гибридной стерильности.

Цель и задачи работы. Целью данного исследования было изучение роли морфологии хромосом в регуляции распределения сайтов инициации синапсиса и точек рекомбинации с помощью иммунофлуоресцентного анализа мейотических клеток у гомо- и гетерозиготных носителей хромосомных перестроек (робертсоновских транслокаций, пара- и перицентрических инверсий) и у межвидовых гибридов, гетерозиготных по нескольким хромосомным перестройкам.

Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:

1. 
   Оценить распределение точек рекомбинации в инвариантных и вариабельных хромосомах обыкновенной бурозубки, определить влияние гомо- и гетерозиготности по робертсоновским транслокациям на рекомбинационные паттерны отдельных плеч хромосом, вовлеченных в перестройки.
   
2. 
   На основе анализа мейоза у домовых мышей – носителей парацентрической инверсии в хромосоме 1, и муйских полевок – носителей перицентрических инверсий в хромосомах 8 и 14, определить влияние гетерозиготности по инверсиям на частоту и распределение сайтов рекомбинации по хромосомам, проанализировать зависимость синаптической подгонки инверсионных петель от локализации сайтов кроссинговера внутри инверсий.
   
3. 
   Установить характер и степень нарушений синапсиса хромосом у самцов и самок гибридов между видами-близнецами серых полевок, различающимися по серии хромосомных перестроек, оценить роль хромосомной дивергенции в возникновении и поддержании в природе гибридной стерильности у данных видов.
   

Научная новизна. С использованием метода иммунолокализации ключевых белков синаписа и рекомбинации впервые установлены особенности распределения сайтов кроссинговера у бурозубок, мышей и полевок – носителей хромосомных перестроек:

• 
  у обыкновенной бурозубки установлено смещение пиков рекомбинации по направлению к теломерам метацентрических хромосом, возникших за счет робертсоновских транслокаций, по сравнению с акроцентрическими вариантами хромосом;
  
• 
  выявлено существенное перераспределение рекомбинационного паттерна у мышей, гетерозиготных по парацентрической инверсии в хромосоме 1, и полное подавление рекомбинации в инвертированных участках хромосом 8 и 14 в природной популяции муйской полевки;
  
• 
  получены данные, свидетельствующие о зависимости степени синаптической подгонки от локализации сайтов кроссинговера в пределах инверсии.
  

Впервые проведен детальный анализ нарушений синапсиса и рекомбинации, приводящих к гибридной стерильности у гибридов двух видов полевок, выявлен половой диморфизм и значительный мозаицизм в степени проявления этих нарушений.

Научно-практическая ценность. Результаты данной работы расширяют представления о клеточных механизмах, регулирующих распределение сайтов инициации синапсиса хромосом и точек рекомбинации. Полученные в работе данные проливают новый свет на механизмы поддержания полиморфизма по хромосомным перестройкам в популяциях млекопитающих, они используются в курсе лекций по эволюционной биологии в Новосибирском государственном университете.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. 
   Изменение морфологии хромосом при хромосомных перестройках приводит к изменению распределения сайтов инициации синапсиса и точек рекомбинации.
   
2. 
   Гетерозиготность по инверсиям у домовых мышей приводит к ослаблению кроссоверной интерференции и вызывает существенное перераспределение рекомбинационного паттерна как в инвертированных, так и в неперестроенных районах хромосом.
   
3. 
   Степень синаптической подгонки инверсионных петель у домовых мышей зависит от локализации сайтов кроссинговера внутри инверсии.
   
4. 
   Стерильность межвидовых гибридов F1 (Microtus arvalis arvalis и M. rossiaemeridionalis) обусловлена полной остановкой мейоза на стадии лептотены-зиготены у самцов и нарушениями синапсиса и рекомбинации хромосом на стадии пахитены у самок.
   

Личный вклад автора. Автор самостоятельно приготовил препараты распластанных синаптонемных комплексов (СК) ооцитов эмбрионов мышей, провел иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов всех исследованных животных, флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH), фотографирование и анализ изображений на флуоресцентном микроскопе и статистический анализ экспериментальных данных.

Апробация работы. Результаты данной работы были представлены и обсуждены: на IV школе молодых ученых ВОГиС по экологической генетике: «Экологическая генетика и теория эволюции» (Санкт–Петербург, 2007), II международной конференции: «Происхождение и эволюция биосферы» (Лутраки, Греция, 2007), международной конференции «Эволюция видов группы Sorex araneus: цитогенетические и молекулярные аспекты» (Йорк, Великобритания, 2008), симпозиуме памяти Г.А Левитского: «Хромосомы и эволюция» (Санкт–Петербург, 2008), V Всероссийском съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), международной конференции EMBO по мейозу (Исль-Сюр-Ла-Сорг, Франция, 2009), международной конференции EMBO по анеуплоидии и сегрегации хромосом (Эдинбург, Великобритания, 2010), международной конференции EMBO по мейозу (Капаччо-Паестум, Италия, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, из них 9 статей в журналах, рекомендованных ВАК и 8 тезисов докладов.

Структура и объём работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список использованной литературы (179 источников). Работа изложена на 133 страницах, содержит 22 рисунка и 10 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. В работе были использованы 22 взрослых самца обыкновенной бурозубки, 11 самок и 7 самцов домовой мыши, 4 самца муйской полевки, 3 самца обыкновенной полевки, 3 самца восточно-европейской полевки и 2 самца и 12 самок гибридов между восточно-европейской и обыкновенной полевками.

Приготовление и иммуноокрашивание распластанных препаратов синаптонемных комплексов мейотических хромосом. Препараты СК распластанных хромосом готовили из сперматоцитов или из ооцитов эмбрионов по методике Петерса с соавторами . Иммуноокрашивание производили по методике Андерсон с соавторами с использованием следующих первичных антител: кроличьих поликлональных против белка бокового элемента СК SCP3 (1:500; Abcam), кроличьих поликлональных против белка центрального элемента СК SCP1 (1:200; Abcam), мышиных моноклональных против белка MLH1 (1:50; Abcam), мышиных моноклональных против белка γH2AX (1:500; Abcam), кроличьих поликлональных против белка RAD51 (1:200; Calbiochem) и антител человека против центромерных белков ACA (1:100; Antiboodies Inc.). В качестве вторичных антител использовали антитела козы против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с флуорохромом FITC (1:50; Jackson ImmunoResearch), антитела козы против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с Cy3 (1:500; Jackson ImmunoResearch), антитела козы против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с Alexa450 (1:100; Invitrogen), антитела осла против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с FITC (1:200; Jackson ImmunoResearch Laboratories) и антитела осла против иммуноглобулинов человека, конъюгированные с FITC (1:100; Vector Laboratories). Антитела были использованы в различных комбинациях в зависимости от задач эксперимента.

Флуоресцентная гибридизация in situ. Гибридизационная проба для хромосомы 1 мыши Dist1 была получена Н.Б. Рубцовым. Для супрессии повторяющихся последовательностей пробу переосаждали с С_оt-1 ДНК мыши. Гибридизацию с пробой Dist1 проводили на препаратах СК распластанных хромосом после иммуноокрашивания по стандартной методике.

Микроскопический анализ и идентификация бивалентов. Препараты анализировали на эпифлуоресцентном микроскопе Axioplan 2 (Carl Zeiss, Германия), оборудованном CCD-камерой (CV M300, JAI), набором фильтров CHROMA и пакетом обработки изображений ISIS4 (MetaSystems GmbH, Германия). Хромосомы обыкновенной бурозубки идентифицировали с помощью DAPI-бэндинга. Хромосому 1 мыши и положение границ инверсии In(1)1Rk определяли с помощью пробы Dist1. Хромосому 14 муйской полевки идентифицировали с помощью гибридизации с хромосом-специфичной пробой (Н.А. Лемская, ИХМИФМ).

Поскольку при гибридизации на препаратах после иммуноокрашивания сигнал MLH1 и ACA удалялся, клетки после иммуноокрашивания фотографировали, записывали координаты, затем, после гибридизации, повторно регистрировали изображение. Такой же подход применяли при использовании антител против центромеры и MLH1, меченых одним и тем же флуорохромом (FITC). Препараты окрашивали последовательно: сначала антителами к MLH1, затем, после фотографирования, антицентромерными антителами ACA.

Измерение и статистический анализ. Измерение размеров бивалентов, регистрацию положения центромеры, гибридизованной пробы, числа и позиции обменов на хромосоме проводили с помощью программы MicroMeasure3.3 . Для статистической обработки результатов использовали пакет программ STATISTICA. Все данные в тексте и таблицах представлены в виде средних значений и стандартных отклонений (M ± SD).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Синапсис и рекомбинация хромосом у носителей робертсоновских транслокаций (на примере обыкновенной бурозубки Sorex araneus).

Обыкновенная бурозубка является хорошей моделью для изучения влияния транслокаций на рекомбинационный паттерн, поскольку для этого вида характерен значительный полиморфизм по робертсоновским транслокациям. Для того чтобы выявить это влияние мы провели анализ общих характеристик синапсиса и рекомбинации у родительских форм и гибридов разных хромосомных рас – гетерозигот по робертсоновским транслокациям методом иммунофлуоресцентной локализации белков осевого элемента синаптонемного комплекса SCP3 и белка мисс-матч репарации MLH1, маркирующего сайты рекомбинации.

В анализе использованы животные, отловленные в гибридной зоне между хромосомными расами Oxford и Wirral. К инвариантной части кариотипа относились хромосомы af, bc, hi, gm, pr, tu и половые хромосомы. К вариабельной части кариотипа относились плечи, j, k, l, n, o, q. Плечи k, n, o, и q присутствовали в кариотипе в виде акроцентриков, либо были слиты в метацентрические хромосомы в различных комбинациях. Мы проанализировали 638 сперматоцитов 22 особей девяти различных кариотипов, различающихся по робертсоновским перестройкам. Всего было локализовано 13983 сайта MLH1 вдоль 7096 аутосом.

В анализируемых клетках СК всех нормальных бивалентов и тривалентов, образующихся при спаривании хромосом, гетерозиготных по робертсоновским транслокациям, были полностью синаптированы, неспаренных участков обнаружено не было. Центромеры в тривалентах были совмещены. Однако в некоторых клетках наблюдалось несовпадение центромер гомологов в нормальных бивалентах (Рис.1). Вероятно, это связано с тем, что после формирования сайтов инициации синапсиса и промежуточных рекомбинационных соединений, дальнейшее спаривание бивалента может осуществляться без сверки гомологии.

Мы построили рекомбинационные карты для хромосом, инвариантных по робертсоновским транслокациям. Основными свойствами рекомбинационного паттерна являлись пики вблизи теломер, снижение частоты обменов вблизи центромеры и би- или мультимодальное распределение вдоль хромосомного плеча.

Для хромосом, полиморфных по робертсоновским транслокациям, мы нашли достоверное различие в распределении сигналов MLH1 среди одинаковых плеч в составе гомозигот-метацентриков, гомозигот-акроцентриков и гетерозигот (Рис.2). У метацентрических хромосом пики рекомбинации были смещены к теломерам по сравнению с акроцентрическими вариантами хромосом. Менее выраженное смещение наблюдалось у гетерозигот по транслокации. Такое смещение, вероятно, обусловлено действием трансцентромерной интерференции.

На наличие этого феномена указывают также результаты анализа расстояний между соседними сайтами рекомбинации в инвариантных хромосомах, имеющих больше одного обмена в плече: дистанции между обменами через центромеру были достоверно больше, чем дистанции в пределах плеча (p<0.001). У гетерозигот по транслокации абсолютные и относительные дистанции между двумя сигналами, разделенными центромерой, были больше, чем у гомозигот - метацентриков, что соответствует смещению пиков рекомбинации к теломерам. Возможно, это связано с задержкой формирования СК в центромерном районе (Богданов, Коломиец, 2007).

Рисунок 1. Сперматоцит обыкновенной бурозубки на стадии пахитены. ДНК окрашена DAPI (синий сигнал). СК выявлен с помощью антител к SCP3 (красный). Сайты рекомбинации выявлены с помощью антител к MLH1 (зеленый). Центромеры выявлены с помощью антицентромерных антител ACA (зеленый), обозначены стрелками и отличаются от сигналов MLH1 яркостью и более диффузным окрашиванием. Буквами обозначены теломерные концы плеч. В бивалентах af и плече d полового тривалента центромеры гомологов смещены друг относительно друга. Масштаб: 5 мкм.

Рисунок 2. Суммарное распределение сайтов MLH1 вдоль плеч вариабельных хромосом обыкновенной бурозубки. Стрелками обозначены центромеры, буквами - теломерные концы соответствующих плеч. Ось X отражает позицию сайта MLH1 относительно центромеры (цена деления 0,5 мкм). Ось Y – число клеток, несущих сайты MLH1 в интервале 0,5 мкм, отнесенное к общему числу клеток, несущих сайты MLH1 в данном плече. Голубым цветом показано распределение для акроцентрических гомозигот, синим – для метацентрических гомозигот, фиолетовым – для гетерозигот по транслокации.

Синапсис и рекомбинация у гомо- и гетерозигот по парацентрическим инверсиям (на примере домовой мыши Mus musculus).

Инверсии, наряду с транслокациями, являются наиболее частыми хромосомными перестройками. Затруднения в выравнивании и синапсисе хромосом у гетерозигот, возникающие вследствие различий в ориентации гомологичных блоков, позволяют оценить влияние топологической структуры бивалента на рекомбинационный паттерн. Для анализа этого влияния мы провели исследование синапсиса и рекомбинации в биваленте 1 самок мышей, гетерозиготных по инверсии In(1)1Rk, а также проанализировали взаимоотношения между синаптической подгонкой и рекомбинацией.

Мы анализировали ооциты эмбрионов, гетерозиготных по инверсии на 16й, 17й и 18й день развития. Большинство проанализированных ооцитов на стадии пахитены содержали полностью спаренные биваленты 1 (Рис.3). Они формировали два типа конфигураций: линейные биваленты и биваленты с инверсионной петлей, в которых инвертированный участок спарен частично или полностью гомологично. В прямых бивалентах инвертированный участок был спарен негомологично.

Соотношение этих двух типов конфигураций существенно менялось от 16 к 18 дню развития. Доля клеток с инверсионными петлями снижалась в течение пахитены (Таблица 1). Вероятно, это обусловлено процессом синаптической подгонки, при которой инверсионные петли постепенно трансформируются в линейные биваленты. На это также указывает значительная вариация относительного размера петель (от 2% до 58% длины бивалента). Однако мы не обнаружили уменьшения среднего размера петли от 16 к 18 дню развития (F=1.8; p=0.2). Можно думать, что замещение гомологичного синапсиса в пределах петли

Рисунок 3. Ооцит мыши, гетерозиготной по парацентрической инверсии In(1)1Rk на стадии пахитены. а. Флуоресцентное иммуноокрашивание. Выявлен СК (SCP3, красные линии), сайты рекомбинации (MLH1, зеленый), клетка окрашена DAPI. б. Флуоресцентная гибридизация in situ. Хромосома 1 идентифицирована с помощью гибридизационной пробы Dist1 (красный диффузный сигнал). Масштаб: 5 мкм.

Таблица 1. Синаптические характеристики и число сайтов MLH1 бивалента 1 в ооцитах, гетерозиготных по инверсии (In1/+) и в нормальных ооцитах.

Карио- тип	День эмбр. развития	Число клеток	Доля клеток с инв. петлями	Относительный размер петли*	Длина СК, мкм	Число сайтов MLH1
In1/+	16	91	0.69±0.05	0.28±0.14	15.06±1.86	1.91±0,75
In1/+	17	459	0.38±0.02	0.24±0.12	13.81±2.25	2.02±0,68
In1/+	18	414	0.28±0.02	0.25±0.13	13.02±2.02	1.92±0,70
+/+	18	225			12.00±1.40	1.64±0.41

* -доля длины петли относительно общего размера СК

на негомологичный и преобразование бивалентов с петлей в прямые биваленты, по всей видимости, происходит довольно быстро.

Мы обнаружили существенное увеличение частоты сайтов MLH1 у гетерозигот по инверсии по сравнению с нормальными гомозиготами (Таблица 2). Среднее число обменов у гетерозигот было на 20% больше, чем в контроле (1.96±0.69 и 1.64±0.41, соответственно, t_{1, 1187}=9.1, p<0.001). При этом биваленты с инверсионной петлей содержали на 24% больше сайтов MLH1, чем прямые биваленты (t_{1, 962} =9.4, p<0.001).

Распределение частот обменов вдоль бивалента 1 также существенно отличалось у гетерозигот и в контроле (Рис.4). У нормальных гомозигот распределение было относительно равномерным, с тремя слабо выраженными пиками. При этом одиночный обмен, как правило, располагался в центральной части бивалента, двойные обмены преимущественно образовывали проксимальный и дистальный пики. У гетерозигот в бивалентах с инверсионной петлей за счет преобладания бивалентов с двумя и тремя обменами над бивалентами с одним обменом пики были выражены гораздо сильнее. Наиболее выраженным был пик в центромерном районе.

В центромерном и теломерном районах прямых бивалентов частота рекомбинации также была существенно выше, чем в соответствующих районах нормальной хромосомы (Рис.4). Инвертированный район прямых бивалентов спарен негомологично, поэтому рекомбинации на этом участке быть не должно.

Таблица 2. Число сайтов MLH1 в биваленте 1 в ооцитах, гетерозиготных по инверсии (In1/+) и в нормальных гомозиготах (+/+) .

Гено-тип	Конфи-гурация	N (СК)	Число (%) клеток, содержащих n сигналов MLH1								Среднее число сигналов MLH1
			n=1		n=2		n=3		n=4
+/+		225	84	(37.3)	137	(60.9)	4	(1.8)	0	0	1.64±0.41
In1/+	бивалент с инв. петлей	352	58	(16.5)	157	(44.6)	130	(36.9)	7	(1.9)	2.24±0.75
In1/+	прямой бивалент	612	185	(30.2)	352	(57.5)	65	(10.6)	0	0	1.80±0.61

Рисунок 4. Распределение сайтов MLH1 вдоль бивалента 1 самок мышей, гетерозиготных по инверсии In(1)1Rk и гомозиготных по нормальной хромосоме 1. Ось X отражает относительное расстояние от сайтов MLH1 до центромеры. Ось Y – частоту сайтов MLH1 на участке 0,05 длины бивалента. Желтым цветом показано распределение для плеч с одним сайтом MLH1, фиолетовым – с двумя, голубым – с тремя, красным – с четырьмя.

Однако 20% таких бивалентов содержали сайт MLH1 примерно в середине инверсии. Мы предполагаем, что они могли образоваться в результате синаптической подгонки в том случае, если обмен произошел в середине инверсионной петли. Обмен, произошедший не в середине петли, должен препятствовать завершению процесса подгонки, поскольку в точке рекомбинации гомологи физически связаны между собой. В таком случае, достигнув сайта рекомбинации, подгонка должна остановиться. В результате образуется бивалент с обменом в основании петли (вблизи точки смены партнера спаривания).

Синапсис и рекомбинация хромосом у гетерозигот по перицентрическим инверсиям (на примере муйской полевки Microtus mujanensis)

Для исследования эффектов перицентрических инверсий мы проанализировали синапсис и рекомбинацию у представителей природной популяции муйской полевки, для которой характерен полиморфизм по числу аутосомных плеч (48-50). Материалом данной части исследования были 4 самца из природной популяции, предоставленные Ф.Н. Голенищевым (ЗИН). Они были проанализированы Н.В. Рубцовой (ИЦиГ) методом дифференциального G-бэндинга и Н.А. Лемской (ИХМИФМ) методом FISH с использованием в качестве зондов хромосом-специфичных проб M.agrestis. Все проанализированные самцы имели одинаковое число хромосом (2n=36, XY), но отличались по числу аутосомных

Рисунок 5. Сперматоцит муйской полевки, гетерозиготной по инверсии в хромосоме 14. Препарат последовательно окрашен мечеными FITC антителами к белку мисс-матч репарации MLH1 (а) и антицентромерными антителами ACA (б) (зеленый). Стрелками показаны позиции центромер: А – акроцентрических хромосом, М – метацентрических. Масштаб 5 мкм.

плеч FNa. Один самец имел нормальный кариотип (FNa=46), в кариотипах остальных присутствовал гетероморфный аутосомный бивалент (FNa=47). Анализ Н.В. Рубцовой, показал, что два самца гетерозиготны по хромосоме 14, один - по хромосоме 8.

Исследование синаптических конфигураций на стадии зиготены выявило инверсионную природу полиморфизма по хромосомам 8 и 14. В небольшом проценте клеток наблюдалось формирование незавершенных инверсионных петель. Полное гомологичное спаривание в пределах петли не достигалось ни в одной клетке. Синапсис, как правило, захватывал центральную часть района инверсии, оставляя неспаренными концы хромосомы. Центромеры акроцентрического и метацентрического гомологов не синаптировали друг с другом. Район, не затронутый инверсией, всегда был гомологично спарен. Это показывает, что точки разрыва инверсии совпадают с концами плеча метацентрической хромосомы, т.е. инверсия охватывает его целиком, не затрагивая соседнее плечо. Размер инверсии в хромосоме 14, оцененный с помощью расстояния между двумя центромерами в линейных бивалентах, составил 3.5±0.6 мкм – около 45% длины бивалента. Небольшой размер и перицентрический характер инверсии, по-видимому, снижают вероятность инициации синапсиса в инвертированном участке и, следовательно, вероятность формирования петли. Краевая локализация инверсии не позволяет петле сформироваться полностью.

У гетерозигот по инверсиям в хромосомах 8 и 14 на стадии пахитены все биваленты были полностью спарены и содержали как минимум один сигнал MLH1 (Рис.5). Анализ рекомбинации в таких бивалентах также подтвердил наличие инверсии. Сигналов MLH1 в плече между центромерами не было обнаружено ни в одной клетке, тогда как другое плечо этого бивалента всегда содержало сайт MLH1.

Синапсис и рекомбинация у гибридов между видами-близнецами, различающимися по кариотипам (на примере гибридов Microtus arvalis arvalis и Microtus rossiaemeridionalis)

Внутривидовая изменчивость по хромосомным перестройкам служит основой для межвидовой дивергенции кариотипов. Принято думать, что накопление хромосомных перестроек в кариотипах близкородственных видов приводит к стерильности их гибридов . В профазе I мейоза у гибридов должны возникать сложности в коориентации гомологичных блоков и, следовательно, нарушения синапсиса и рекомбинации, приводящие к неправильной сегрегации хромосом и анеуплоидии, инактивации транскрипции и апоптозу. Для исследования того, в какой степени именно эти причины обусловливают гибридную стерильность, мы проанализировали синапсис и рекомбинацию в сперматоцитах и ооцитах гибридов двух видов-близнецов полевок: M. a. arvalis (2n=46, NF=84) и M. rossiaemeridionalis (2n=54, NF=56) на разных стадиях мейоза, а также в пахитенных клетках самцов родительских видов. Родительские виды различаются по серии центрических и тандемных транслокаций, пара- и перицентрических инверсий, образованию неоцентромер и блоков гетерохроматина (Mazurok et al., 2001). Исходя из их кариотипов, у гибридов должно возникать 18 гомо- и гетероморфных бивалентов и 4 тривалента. Однако такая ожидаемая картина на стадии пахитены наблюдалась только в небольшом числе клеток и только у самок.

У самцов мейоз останавливался на границе между лептотеной и зиготеной. В части клеток осевые элементы СК формировались нормально, однако синапсис между ними был нарушен. Нарушения касались всех хромосом, в том числе не затронутых перестройками. Это указывает на то, что проблемы в спаривании хромосом, несущих перестройки, отличающие эти два вида, не являются единственной причиной гибридной стерильности. Вероятно, вклад в установление гибридной стерильности вносит также генетическая дивергенция.

У самок нарушения мейоза были выражены значительно слабее и проявлялись в разной степени в разных клетках. В большинстве случаев ооциты достигали стадии пахитены. Большая часть клеток (73%) содержала мультиваленты, включающие больше хромосом, чем можно ожидать на основании сравнительного анализа кариотипов (от 4 до 20 осевых элементов) (Рис.6 а). Число бивалентов варьировало от 8 до 23, большинство были полностью спарены, тогда как мультиваленты часто содержали неспаренные участки. В 41% клеток мы обнаружили от 1 до 8 унивалентов. Таким образом, даже на стадии пахитены во многих клетках оставались протяженные участки асинапсиса. В то же время, в 7.7% ооцитах число и морфология синаптических конфигураций соответствовали ожидаемым: 19 бивалентов (18 аутосом и XX) и 4 тривалента (Рис.6 б).

Ооциты гибридов вовлекались в нормальный процесс рекомбинации, на что указывает наличие сайтов связывания MLH1 (Рис.6 а). Однако их частота была



Рисунок 6. Ооциты гибридов полевок M. а. аrvalis, и M.rossiaemeridionalis. а. Клетка окрашена DAPI (синий). Выявлены СК (SCP3 - красный) и сайты рекомбинации (MLH1 - зеленый) б. Выявлены СК (SCP3 – синий, SCP1- красный) центромеры (ACA, зеленый). Масштаб: 5 мкм.

снижена по сравнению с родительскими видами. Среднее число сайтов MLH1 в пахитенных ооцитах гибридов составило 23.2±3.4 на клетку (с разбросом от 15 до 30), у самцов M. a. arvalis - 27.6±1.2, у M.rossiaemeridionalis - 27.8±2.1. Однако, похоже, что это снижение не является критичным и связано с затруднениями поиска гомологичных участков в перестроенных хромосомах.

Обсуждение

Пространственная организация хромосом в профазе мейоза и синапсис хромосом у гетерозигот по перестройкам.

Выравнивание или коориентация хромосом в начале профазы мейоза играет решающую роль в определении точек инициации синапсиса и распределении сайтов рекомбинации. Наиболее хорошо изученным механизмом пресинаптического выравнивания хромосом является кластеризация теломер в конце лептотены – начале зиготены. Сближение концов хромосом обеспечивает более эффективный поиск гомологии. Различия в морфологии между гомологами у гетерозигот по хромосомным перестройкам осложняет процесс их коориентации. У гетерозигот по робертсоновским транслокациям и по полноплечевым перицентрическим инверсиям в теломерную кластеризацию вовлекаются дистальные концы метацентрика и дистальные и проксимальные (центромерные) концы акроцентрика, центромера метацентрика не включается в кластер. Ближайшим следствием этого является задержка в образовании синапсиса в околоцентромерных районах робертсоновских тривалентов (Богданов, Коломиец, 2007) и инверсионных бивалентов. Более отдаленным последствием может быть дистализация пиков рекомбинации у гетеро- и гомозигот-метацентриков в сравнении с гомозиготами-акроцентриками, подобное обнаруженному в эксперименте на бурозубках, и подавление рекомбинации в районе инверсии за счет негомологичного синапсиса, обнаруженное у муйской полевки.

Замена гомологичного синапсиса на негомологичный в результате синаптической подгонки

К негомологическому синапсису в районе инверсии может также приводить процесс синаптической подгонки инверсионной петли. У мышей, гетерозиготных по хромосоме 1, мы нашли свидетельства в пользу этой гипотезы: уменьшение частоты клеток с инверсионными петлями в течение пахитены.

Согласно модели синаптической подгонки линейный бивалент образуется путем постепенного замещения гомологичного синапсиса на негомологичный, начиная с концов петли . Мозес с коллегами предполагали, что подгонка может препятствовать рекомбинации в районе замещения гомосинапсиса на гетеросинапсис и предотвращать негативные последствия рекомбинации в петле. Однако это предположение было основано на представлении, что кроссинговер происходит во время или после синаптической подгонки. Современные данные показывают, что инициация рекомбинационных событий происходит уже в ранней профазе (Hunter, Kleckner, 2001). Физическая связь между гомологами формируется до завершения синапсиса и начала подгонки.

Мы полагаем, что позиция кроссоверного обмена в инверсионной петле может влиять на степень синаптической подгонки. Чем ближе к границе петли расположен обмен, тем меньшая степень подгонки возможна. Петля может быть полностью подогнанной только в случае, когда кроссинговер произошел в ее середине. Данные, полученные нами для гетерозигот по инверсии в хромосоме 1 мыши, подтверждают это предположение. Похоже, что этот феномен характерен не только для данной инверсии. У свиней, гетерозиготных по перицентрической инверсии, прямой бивалент с негомологично спаренным инвертированным районом был обнаружен в 92% сперматоцитов . В 1.5% из них в инвертированном участке был зафиксирован сигнал MLH1, что указывает на то, что такие биваленты, скорее всего, были образованы путем синаптической подгонки.

Нарушения спаривания хромосом у межвидовых гибридов

Считается, что нарушения синапсиса, рекомбинации и сегрегации хромосом, часто наблюдаемые у межвидовых гибридов, являются прямым следствием гетерозиготности по хромосомным перестройкам . При большом числе перестроек поиск гомологичных участков и спаривание хромосом должны быть существенно затруднены. Нарушения должны проявляться на стадии зиготены-пахитены у обоих полов, приводить к появлению протяженных участков асинапсиса и к апоптозу. В некоторых случаях, однако, механизм синаптической подгонки может помочь избежать образования неспаренных участков за счет негомологичного синапсиса. В нашем исследовании у самок гибридов между M. a. arvalis и M.rossiaemeridionalis, в некоторых клетках, действительно, наблюдалось полное спаривание всех хромосом. Тем не менее, в большинстве клеток мы наблюдали нарушения синапсиса, проявляющиеся в разной степени и затрагивающие как перестроенные, так и неперестроенные хромосомы. Такая картина говорит о том, что хромосомные перестройки, отличающие эти два вида, сами по себе не являются основной причиной гибридной стерильности.

Изменение паттернов рекомбинации у носителей хромосомных перестроек, его причины и эволюционные последствия

На всех исследованных моделях мы обнаружили существенные изменения распределения сайтов кроссинговера по хромосомам у гетеро- и гомозиготных носителей хромосомных перестроек в сравнении с нормальными гомозиготами.

Дистализация пиков рекомбинации у гетерозигот по робертсоновским транслокациям и у гомозигот-метацентриков по сравнению с акроцентриками, обнаруженная у бурозубок, по-видимому, обусловлена как особенностями инициации, так и трансцентромерной интерференцией. Такая дистализация должна иметь значительные эволюционные последствия. Районы, которые были рекомбинационно активными в составе акроцентриков, становятся «холодными» районами рекомбинации в составе метацентриков. Гены, локализованные в них по обе стороны от центромеры, начинают наследоваться как единые блоки. Это создает возможность образования супергенов или коадаптированных генных комплексов, дифференцирующих изолированные популяции (Burton et al., 1999). В акроцентрических хромосомах образование таких комплексов менее вероятно.

Еще более сильное изменение рекомбинационного паттерна наблюдается у гетерозигот по инверсиям. При этом разные типы инверсий приводят к разным последствиям. Большой размер и центральное положение парацентрической инверсии в хромосоме 1 мыши определяют высокую частоту образования бивалентов с инверсионными петлями. В таких бивалентах резко повышается частота рекомбинации, что сильнее всего выражается в появлении нехарактерного, сильного пика в перицентромерной области. Такие существенные изменения параметров рекомбинации могут компенсировать негативный эффект инверсии, позволить преодолеть барьер пониженной приспособленности гетерозигот и привести к распространению и фиксации данной инверсии.

Увеличение частоты рекомбинации говорит о существенном снижении кроссоверной интерференции. Мы предполагаем, что причиной этого может быть изменение пространственной организации бивалента (формирование инверсионной петли). Точки смены партнера спаривания петли могут являться препятствием для проявления эффекта интерференции, а разделенные ими участки хромосомы восприниматься «машиной интерференции» как независимые. Снижение интерференции в прямых бивалентах может объясняться тем, что большая их часть образована путем синаптической подгонки бивалентов с инверсионными петлями.

В отличие от мышей, у гетерозигот по полноплечевым перицентрическим инверсиям муйской полевки наблюдается полное подавление рекомбинации в инвертированном участке и крайне редкое образование инверсионных петель. Это, вероятно, обусловлено краевым положением и небольшим абсолютным размером инверсии. Интересно, что у муйской полевки, малочисленного вида, населяющего небольшую территорию, обнаруживается высокий процент гетерозигот по инверсиям. Подавление кроссинговера в инвертированных плечах хромосом за счет негомологичного синапсиса у гетерозигот предотвращает образование дефектных хромосом. Благодаря этому у них не снижается плодовитость, и инвертированные хромосомы не подвергаются элиминации естественным отбором.

ВЫВОДЫ

1. 
   Впервые с использованием иммунолокализации белков синаптонемного комплекса (SCP3, SCP1) и рекомбинационных узелков (RAD51, MLH1) в сочетании с флуоресцентной гибридизацией in situ с ДНК зондами был проведен детальный анализ синапсиса и рекомбинации хромосом у гомо- и гетерозиготных носителей хромосомных перестроек (робертсоновских транслокаций, парацентрической и перицентрических инверсий) у обыкновенной бурозубки, домовой мыши и муйской полевки, а также у гибридов между двумя видами серых полевок, различающимися по нескольким хромосомным перестройкам. Установлено, что изменение морфологии хромосом при хромосомных перестройках приводит к изменению распределения сайтов инициации синапсиса и точек рекомбинации.
   
2. 
   Впервые охарактеризованы рекомбинационные паттерны хромосом обыкновенной бурозубки, инвариантных и вариабельных по робертсоновским транслокациям, получена оценка общей длины рекомбинационной карты этого вида (1145 сМ). У гомо- и гетерозигот по метацентрическим вариантам хромосом установлено смещение пиков рекомбинации по направлению к теломерам по сравнению с акроцентрическими вариантами хромосом.
   
3. 
   У мышей, гетерозиготных по парацентрической инверсии в хромосоме 1, выявлено увеличение частоты и изменение распределения сайтов кроссинговера по данной хромосоме, связанное с ослаблением интерференции. Впервые показано, что степень синаптической подгонки инверсионных петель зависит от локализации сайтов кроссинговера внутри инверсии.
   
4. 
   Установлена инверсионная природа полиморфизма по хромосомам 8 и 14 в природной популяции муйской полевки. Обнаружено полное подавление рекомбинации в инвертированных участках этих хромосом, обусловленное негомологичным спариванием.
   
5. 
   Впервые описаны нарушения синапсиса хромосом, обусловливающие стерильность гибридов между видами-близнецами Microtus arvalis и M. rossiaemeridionalis, различающимися по серии хромосомных перестроек. У самцов нарушения выражены сильнее и приводят к остановке мейоза уже на стадии лептотены-зиготены, у самок наблюдается мозаицизм по степени нарушений в пахитене, которые выражаются в образовании унивалентов и мультивалентов, включающих как перестроенные, так и неперестроенные хромосомы.
   

Список статей по теме диссертации, опубликованных в рецензируемых журналах:

1. 
   Borodin P.M., Karamysheva T.V., Belonogova N.M., Torgasheva A.A., Rubtsov N.B., Searle J.B. Recombination map of the common shrew, Sorex araneus (Eulipotyphla, Mammalia) // Genetics. 2008. V. 178. 621-632.
   
2. 
   Бородин П.М., Башева Е.А., Белоногова Н.М., Торгашева А.А. Рекомбинация и эволюция // Вестник ВОГиС. 2008. Т. 12 №1/2. 197-205.
   
3. 
   Торгашева А.А., Железова А.И., Рубцов Н.Б., Бородин П.М. Влияние пола и порядка генов на частоту и распределение рекомбинационных событий в хромосоме 1 домовой мыши // Доклады академии наук. 2009. Т. 429 № 5. 710–712.
   
4. 
   Бородин П.М., Башева Е.А., Голенищев Ф.Н., Дашкевич О.А., Картавцева И.Н., Потапов М.А., Сакаева Г.Р., Торгашева А.А., Фрисман Л.В. Иммунофлуоресцентный и электронно-микроскопический анализ спаривания и рекомбинации хромосом в мейозе четырех видов полевок рода Microtus (Arvicolinae, Rodentia) // Вестник ВОГиС. 2010. Т. 14 № 1. 89-95.
   
5. 
   Бородин П.М., Торгашева А.А., Высоцкая Л.В. Рецензия на книгу Ю.Ф. Богданова и О.Л. Коломиец “Синаптонемный комплекс – индикатор динамики мейоза и изменчивости хромосом” (М., Товарищество научных изданий КМК, 2007. 358 с.) // Генетика. 2010. Т. 46 № 5. 718–720.
   
6. 
   Basheva E.A., Torgasheva A.A., Sakaeva G.R., Bidau C., Borodin P.M. A- and B-chromosome pairing and recombination in male meiosis of the silver fox (Vulpes vulpes L., 1758, Carnivora, Canidae) // Chromosome research. 2010. V. 18. 689-696.
   
7. 
   Бородин П.М., Башева Е.А., Торгашева А.А., Голенищев Ф.Н., Картавцева И.В. Синапсис и рекомбинация хромосом у муйской полевки (Microtus mujanensis) // Вестник НГУ. 2010. Т.8 №3. 124-130.
   
8. 
   Torgasheva A.A., Borodin P.M. Synapsis and recombination in inversion heterozygotes // Biochem Soc Trans. 2010. V. 38(6). 1676–1680.
   
9. 
   Бородин П.М., Торгашева А.А. Хромосомные инверсии в клетке и в эволюции // Природа. 2011. N 1. С. 19-26.