Становление медиаторного этапа нервного аппарата челюстно-лицевой области в пренатальном онтогенезе человека и лабораторных животных 14. 00. 02 анатомия человека

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Республика Казахстан

Алматы, 2010
Работа выполнена в Казахском национальном медицинском университете им. С. Д. Асфендиярова

Научные консультанты

доктор медицинских наук, профессор Досаев Т. М.

доктор медицинских наук, профессор Есембаева С. С.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Алмабаев Ы. А.

доктор медицинских наук, профессор Аубакиров А. Б.

доктор медицинских наук, профессор Мукашев М. Ш.

Защита состоится 29 ноября в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 09.01.03 при Казахском национальном медицинском университете им. С. Д. Асфендиярова (050012 г. Алматы, ул. Толе би, 94, актовый зал)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КазНМУ им. С. Д. Асфендиярова (050012, г. Алматы, ул. Богенбай батыра, 153).
Автореферат разослан «____» _________________ 2010г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук,

профессор Нурмухамбетова Б. Н.
ВВЕДЕНИЕ
Врожденные пороки развития человека, являясь причинами различных тяжелых заболеваний, ведущих к инвалидности и последующей ранней смертности детского и взрослого населения, представляют собой серьезную проблему, как с медицинской, так и социальной точек зрения. Особую тревогу вызывает то, что среди прочих врожденных пороков развития органов и систем человеческого организма (далее ВПР), одними из наиболее часто встречающихся являются пороки с локализацией в челюстно-лицевой области (далее ЧЛО). Так, согласно мировой статистике, частота рождения детей с расщелинами губы, альвеолярных отростков и неба составляет, в среднем, 1-2 случая на 1000 новорожденных детей (Л.А. Жученко, 2003; Г.И. Лазюк, Л.П. Назаренко, 2008; B. Brondel, V. Ringe, 2009). В различных регионах их популяционная частота варьирует от 1:1000 до 1:700 в год. Причем, последние два десятилетия характеризуются заметным ухудшением положения, что, по мнению ряда исследователей, в первую очередь связано с ухудшением экологического состояния окружающей среды, в целом (Ахтемійчук Ю. Т. , 2008; Барсуков А. Н., Шаповалова Е. Ю. и др. 2009)

Большинство исследователей, занимавшихся изучением данной проблемы, вынуждены были констатировать, что, несмотря на предпринимаемые усилия, направленные на лечение и реабилитацию этих детей, число инвалидов к пубертатному возрасту, к сожалению, не уменьшается (Sano M., Murakami H., 2008; Ефремов Г. И., 2009). В исследованиях недостаточно освещается прогностическая значимость тех или иных факторов риска возникновения ВПР ЧЛО. Видимо, поэтому на сегодняшний день в казахстанском здравоохранении отсутствуют методы прогнозирования ВПР на этапе планирования беременности, хотя возможность предупреждения их формирования на этапе предгравидарной подготовки доказана ранее.

Основополагающим в разработке мер профилактики является расширение и углубление представлений о причинах и механизмах развития ВПР.

Все виды повреждающих воздействий, приводящих к возникновению врожденных пороков развития (далее ВПР), по первичному механизму можно разделить на две группы: генетические повреждения и эпигеномные воздействия через негенетические молекулярные структуры клеток, т.е. все типы нарушений динамики обмена или молекулярных структур на постгенетическом уровне. К одному из ведущих механизмов регуляции этого уровня относится нервная система. Роль нервной системы в развитии плода заключается, прежде всего, в том, что, только после обеспечения органа нервными структурами возможен процесс его становления и функционирования, т.е. существует зависимость между иннервацией органа и развитием его структурно-функциональных единиц. Если нарушается нервная трофика органа, то его нормальное формирование, не говоря уже о функции, невозможно (Дыгало Н.Н., Юшкова А.А., Калинина Т.С., 2008).

При формировании нервной системы эмбриона, в частности нервных сплетений различных органов, нейромедиаторы, осуществляющие передачу возбуждения в синапсах, появляются в нервных волокнах не сразу, а после того, как дендриты, аксоны, а также нейробласты проникнут в органы или в характерные области локализации нервного узла. В связи с этим, в онтогенезе выделяют домедиаторный и медиаторный этапы развития и функционирования вегетативной нервной системы (Бузников Г.А., 2000; Васильев Д. С.,2008)..

В домедиаторный период регулирующее влияние на развитие плода оказывает нервная система организма матери. Поскольку между организмом матери и плода не существует анатомической нервной связи, нервные импульсы передаются гуморально – с помощью медиаторов. Медиаторы синтезируются матерью, проходят через плацентарный барьер и влияют на ход развития зародыша. Они необходимы для процессов эмбриогенеза, о чем свидетельствуют тератологические эффекты веществ, препятствующих их обмену (Отеллин В.А., Xожай Л.И., 2007).

Несмотря на значительный объем и глубину проведенных исследований, нам не удалось получить ответа на ряд важных вопросов, прежде всего связанных с патогенетическим механизмом развития ВПР ЧЛО. В литературных источниках имеется описательная информация, основанная на умозаключениях, иногда противоречивых.

Кроме того, в разработке проблем пато- и морфогенеза ВПР ЧЛО, на наш взгляд, необоснованно мало внимания уделяется проблемам нарушений со стороны нейроэндокринной регуляции органов-«мишеней», морфологическим субстратом которых являются различные отделы вегетативной нервной системы. Экспериментальное изучение этих вопросов позволит по-новому взглянуть на проблему ВПР и на основе этого подойти к разработке новых подходов к их морфологической диагностике и профилактики в клинике. С этих позиций актуальным представляется фундаментальное морфо-функциональное исследование особенностей формирования отделов вегетативной нервной системы при экспериментальном дисбалансе нейромедиаторов.

1. 
   Определить сроки и особенности становления медиаторного этапа в развитии нервного аппарата челюстно-лицевой области
   
2. 
   Изучить особенности морфогенеза нервного аппарата челюстно-лицевой области на этапах пренатального онтогенеза в условиях изменения концентрации основных нейромедиаторов
   
3. 
   Выявить морфометрические критерии нарушения сроков становления медиаторного этапа в развивающейся челюстно-лицевой области
   
4. 
   Определить роль вегетативной дисрегуляции в патогенезе врожденных пороков развития челюстно-лицевой области.
   
5. 
   Изучить медико-социальные факторы риска формирования ВПР ЧЛО и определить их прогностическую значимость
   
6. 
   Разработать программу этиопатогенетической профилактики ВПР ЧЛО
   

Установлены сроки и особенности становления медиаторного этапа в нервном аппарате ЧЛО. В течение 8 недели эмбрионального развития появляются холинергические волокна, в течение 10 недели – адренергические. Процесс становления функционирования серотонинергической нервной системы имеет более затяжной характер, и конкретизация сроков его наступления затруднена, тем не менее, первые серотонинспецифичные нервные окончания обнаруживаются на 9-11 неделе внутриутробного развития.

Получены данные, свидетельствующие о том, что воздействие повреждающего фактора в домедиаторный период приводит к более существенным нарушениям развития ЧЛО, чем воздействие тех же факторов в период сформированного нервного аппарата ЧЛО.

В комплексном сравнительном исследовании раскрыты закономерности морфофункциональных преобразований в отделах вегетативной нервной системы ЧЛО эмбриона при дефиците нейромедиаторов крови матери. Параллельно показаны изменения гистогенеза ЧЛО, в механизме которых существенную роль играет данная вегетативная дисрегуляция. Впервые обоснованы математически достоверные количественные критерии патологических преобразований в тканях ЧЛО при нарушении нейрогенеза.

На основании анализа клинико-анамнестических данных, полученных в результате скринингового анкетирования, дана качественная и количественная оценка приоритетным медико-социальным факторам риска формирования врожденных пороков развития ЧЛО плода в РК, выявляемых еще на этапе планирования беременности. По результатам комплексного анализа полученных данных разработана модель определения риска формирования ВПР ЧЛО.

Результаты исследования позволили создать и научно обосновать комплекс мер этиопатогенетической профилактики ВПР ЧЛО с учетом особенностей пренатального онтогенеза ЧЛО.

Определены критические периоды формирования челюстно-лицевой области в пренатальном онтогенезе, которые приходятся у человека на 18-23 стадии по Карнеги. Доказана важная, если не ведущая, роль нарушения сроков и последовательности становления медиаторного этапа вегетативной нервной системы ЧЛО в патогенезе врожденных аномалий лица и челюстей.

Установлено, что в период формирования нервного аппарата (домедиаторный период), ЧЛО значительно более уязвима к воздействию повреждающих факторов, нежели в период развития собственно мезенхимальных структур.

Эти результаты позволяют прогнозировать возможность врожденного порока ЧЛО у ребенка еще во время предгравидарной подготовки, что дает возможность разработки системы индивидуальных профилактических мероприятий. Возможность математического прогноза ВПР ЧЛО позволяет более целенаправленно обследовать плод в антенатальном периоде. Это позволяет определить тактику ведения беременности на ранних сроках гестации.

Полученные данные легли в основу программы профилактики ВПР ЧЛО с учетом особенностей пренатального онтогенеза ЧЛО.
Основные положения, выносимые на защиту

1. 
   Развитие нейромедиаторной дисрегуляции со стороны матери сопровождается морфофункциональной перестройкой отделов вегетативной нервной системы эмбриона, что приводит к нарушению становления медиаторного этапа в ЧЛО.
   
2. 
   Этот процесс находится в прямой взаимосвязи с морфологическими изменениями в развивающейся челюстно-лицевой области, степень поражения зависит от времени воздействия и приводит к формированию ВПР ЧЛО.
   
3. 
   Факторами риска формирования ВПР ЧЛО, выявляемыми на этапе планирования беременности и на ранних сроках гестации являются: вирусный гепатит А, хронические отит, бронхит, гайморит, тонзиллит, пиелонефрит, холецистит, цистит; кольпит; ОРВИ, перенесенные в период беременности.
   
4. 
   Разработанный комплекс организационных мер профилактики врожденных пороков развития челюстно-лицевой области, научно обоснованный результатами экспериментально-морфологических и клинико-эпидемиологических исследований является эффективным инструментом снижения частоты ВПР ЧЛО в РК
   

Основные научные результаты опубликованы в 36 научных работах, из которых 13 - в научных изданиях, рекомендованных Комитетом по контролю в сфере образования и науки МОН РК, 15 - написаны без соавторства; 6 – в изданиях дальнего зарубежья. По материалам диссертации изданы 3 учебных пособия.

Основные положения диссертационной работы изложены на:

Международной научно-практической конференции (16-17 октября, 2008), «Актуальные вопросы патофизиологии и медицины» Алматы, 2008; Международной конференции (Польша, 2008) Miedzynarodowej konferencji “Naukowy potencjal swiata -2008” 12-20 wrzesnla 2008 roku, tum 8 Medycyna Naukl biologiczne Weterynaria, Przemysl, Nauka I studia; Международной научно-практической конференции (Болгария, 2008) «Бъдещето проблемите на световната наука – 2008» 17-25 декември 2008.- София «Бял ГРАД-БГ; Мiedzynarodowej konferencji “Naukowy potencjal swiata -2008” 12-20 wrzesnla 2008 roku, Medycyna Naukl biologiczne Weterynaria, Przemysl, Nauka I studia; Научно-практической конференции в рамках «Дни университета» Алматы, декабрь, 2008г.; Международной научно-практической конференции (Кейптаун, 2008) The 17 cоnference of the international federation of associations of anatomists (IFAA); Международном Конгрессе врачей-стоматологов «Проблемы современной стоматологии Казахстана» Алматы, 11-14 мая 2008г.; Международной научно-практической конференции «Приоритеты реализации программы профилактики стоматологических заболеваний у детей» Алматы, 12-15 мая 2009г.; Евразийском симпозиуме «Проблемы саногенного и патогенного эффектов эндо- и экзоэкологического воздействия на внутреннюю среду организма» по вопросам фундаментальной и прикладной медицины, 13-16 августа.- Бишкек, 2009г.; Республиканской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75 – летию кафедры клинической анатомии и оперативной хирургии «Современные проблемы теоретической и клинической морфологии» 3 декабря.- Алматы, 2009; V Mezinarodni vedecko – prakticka conference “Veda a vznik – 2009/2010” 27 prosincu 2009 – 05 ledna 2010 Dil 19 Lekarstvi Zverolekarstvi biologicke vedy chemie a chemicka technologie ekologie zemepis a geologie.- Praha, 2009-2010; X конгрессе Международной ассоциации морфологов (29-30 сентября, 2010г. - г. Ярославль)

Предварительное обсуждение диссертации проведено на совместном заседании морфологических кафедр и НППК КазНМУ им. С.Д. Асфендиярова и ученого совета Алматинского стоматологического института последипломного обучения (07.04.2010г).

Материалом для исследования в 4 главе служили зародыши человека, находившиеся на 17 (11 - 14 мм теменно-копчиковой длины) – 23 (28-30 мм ТКД) стадиях эмбрионального развития по Карнеги (O'Rahilly R. et al., 1981) . Зародышей получали в родильных домах № 1 и № 2 г. Алматы в результате abrasio при неотягощенной беременности, а также использовали микропрепараты из коллекции кафедры. Всего было изучено 144 эмбриона. Распределение объектов исследования по стадиям эмбриогенеза приведено в таблице

Таблица 1 – Характеристика эмбриологического материала человека

Стадия Карнеги	Кол-во образцов
17	11
18	15
19	19
20	22
21	25
22	26
23	26

Материал фиксировали 12%-ным нейтральным формалином или холодным ацетоном и по стандартной методике заключали в парафиновые блоки, из которых готовили серийные срезы толщиной 10 мкм.

В 5 главе работа носила экспериментальный характер и была выполнена на белых беспородных крысах, содержавшихся в стандартных условиях вивария КазНМУ, то есть при температуре 22 – 24 градуса, естественном освещении, свободном доступе к корму и воде.

Протокол экспериментов в разделах выбора, содержания животных, моделирования патологических процессов и выведения их из опыта был составлен в соответствии с рекомендациями ВОЗ.

Перед включением в эксперимент все животные прошли необходимый карантин и подвергались осмотру перед исследованием. Все болезненные процедуры и выведение из эксперимента проводили с использованием нембутала (наркоз в дозах 30-50 мг/кг массы, эвтаназия - 100-150 мг/кг массы, в зависимости от вида животных). Контрольные группы формировались с учетом массы и возраста животных, во всех случаях определены границы биологической нормы для всех тестируемых показателей.

Для получения самок с датированным сроком беременности 3 самки ссаживали с 1 самцом. Первым днем беременности считали день обнаружения спермы во влагалищном мазке. Покрытых самок рассаживали по разным клеткам. В работе использовали эмбрионы первой трети беременности (14, 15, 16,-дневные и новорожденных крысят обоего пола.

Закономерности морфофункциональных преобразований в нервном аппарате ЧЛО и параллельно развивающиеся изменения в тканях и органах-мишенях были изучены в эксперименте с использованием трех моделей ингибирования трансмиттеров.

Животные каждой серии эксперимента делились на группы в зависимости от времени экспериментального воздействия. В первой группе эксперимент начинался на 9 сутки (Е9) пренатального онтогенеза. Во второй - на 13 сутки (Е13) пренатального онтогенеза.

Гистологическое исследование проводили на 16 сутки эмбриогенеза (Е 16) и в первый день постнатального онтогенеза. В соответствии со временем проведения исследования группы животных во всех трех сериях были разделены на подгруппы.

В качестве контроля использовали блоки ЧЛО потомков соответствующих стадий развития, полученных от матерей, которым вводили физиологический раствор на соответственных сроках беременности. Распределение животных по группам представлено в таблице.

Биохимическая верификация деплеции нейротрансмиттера проведена во всех сериях экспериментов.

При морфологическом исследовании тканей ЧЛО были использованы общепринятые методики с окрасками гематоксилином и эозином, кармином (по Бесту), по Фельгену, Суданом III и нильским голубым. В двух последних случаях использовали свежезамороженные срезы. Исследование нервной ткани было дополнительно проведено при окраске по Нисслю, серебрением после фиксации в растворе Буэна.

Полученные микропрепараты были описаны, с типичных из них - изготовлены микрофотограммы. Фотосъемка препаратов проведена с использованием мультиголовочного микроскопа «Leika» (Швейцария) на кафедре патологической анатомии и судебной медицины КазНМУ. В дальнейшем съемка сочеталась с количественным морфологическим исследованием. Морфометрическое исследование было проведено в соответствии со сложившимися принципами системного количественного анализа [Автандилов Г.Г., 1996,2002].

Для прямого морфометрического исследования был использован компьютерный комплекс «Морфотест» (Россия). Он включал в себя бинокулярный исследовательский микроскоп «Leika», аналого-цифровой преобразователь, компьютер с высокоразрешающим цветным принтером и программное обеспечение.

Морфометрические исследования были также проведены в ядросодержащих и проводящих структурах нервной системы. В качестве показателей состояния нейронов были выбраны средний объем ядер (мкм³), объемная доля ядер (мкм³/мкм³) и площадь поверхности ядер (мкм²). Для характеристики нервных структур использовали такие показатели, как относительный объем (мкм³/мкм³) и плотность осевых цилиндров (на 1 мм сечения) и среднее сечение осевого цилиндра (мкм²).
Флуоресцентно—гистохимические и цитоспектрофлуориметрические методы:

Использовали метод Фалька-Хилларпа в модификации Е.М.Крохиной для выявления медиаторспецифичных нервных элементов в криостатных срезах блоков ЧЛО эмбрионов крыс.

Флуоресцентно-гистохимический метод А. Бъерклунда в модификации В.Н.Швалева и Н.И. Жучковой (1987) с использованием глиоксиловой кислоты для выявления нейромедиаторов в нервных волокнах на криостатных срезах блоков ЧЛО.

По замерам интенсивности флуоресценции можно судить о количественном содержании (концентрации) катехоламинов (Гордон Д.С. и др., 1982; Виноградов О.Ю., 1989; Scheuermann W., Stach W.,1987).

Для выявления холинергических нервных окончаний материал обрабатывали по методу Карновского – Рутс.

Выявление хромаффинной ткани по Визелю (Wiesel).

В результате окраски по Визелю хромаффинные клетки окрашиваются в зеленый цвет, а остальные клетки (строма, нервные клетки) - в синеватый цвет.

При проведении сравнительного анализа морфометрических данных пренатального онтогенеза человека и белых беспородных лабораторных крыс необходимо было соотнести между собой дни развития их организмов.

Для этого мы воспользовались методом, предложенным О.А. Гелашвили (2007).
2.1.4 Математическая обработка полученных данных

Статистическая обработка проведена общепринятыми для медико-биологических исследований методами с помощью программных пакетов. При регрессионном анализе выявлены наиболее значимые показатели, определение которых целесообразно для оценки влияния концентрации материнских нейротрансмиттеров на выраженность повреждения тканей ЧЛО.

Корреляционный анализ проводился методом простых парных корреляций Спирмена. Особое внимание уделяли корреляциям между показателями выраженности нарушений в нервном аппарате и морфометрическими показателями в тканях развивающейся ЧЛО (ось «тяжесть — гистопатология»). Достоверными считали корреляции с показателем r, по модулю большим 0,66 [Платонов А.Е., 2000; Петри Л., Сабин К., 2003].
2.2 Изучение частоты и структуры ВПР ЧЛО в Республике Казахстан

В соответствии с поставленными целью и задачами, на первом этапе нами была изучена распространенность и структура врожденных пороков развития в Республике Казахстан за период с 2000 - 2009 гг. Частоту рождения определяли в интенсивных показателях - на 1000 живорожденных. Был изучен вклад пороков развития челюстно-лицевой области в структуру ВПР за исследуемый период. Исследование проводилось ретроспективно, путем изучения официальных статистических данных Минздрава РК, публикуемых в «Сборнике статистических показателей» ежегодно, изучения источников Медицинского информационно-аналитического центра (МИАЦ), путем анализа материалов отчетности главных стоматологов областей РК.

Далее был изучен спектр и динамика пороков развития челюстно-лицевой области за период исследования. Источник информации оставался прежним.