Загальна характеристика роботи

Перитоніт відносять до важких інфекцій із незадовільним прогнозом: летальність при перитоніті складає від 3,5 % (при проникаючих пораненнях черевної порожнини і ранньому оперативному лікуванні) до 60 % при абдомінальному сепсисі з поліорганною недостатністю (ПОН) (Стручков Ю. В., Горбачева И. В., 2007, Козлов Р. К., 2007).

Існують різні форми гострого перитоніту, які сприяють проявам як місцевого так і загального характеру і відрізняються діапазоном впливу інтоксикації на функції органів та систем організму людини. За окремими параметрами перитоніт поділяють на первинний, який виникає внаслідок попадання мікрофлори до черевної порожнини гематогенним або лімфогенним шляхом, та вторинний, який є наслідком розповсюдження запального процесу з органів і тканин черевної порожнини, заочеревинного простору, перфорації органів тощо. Окремо виділяють післяопераційний, травматичний, акушерський, гінекологічний, жовчний, сечовий перитоніти (Стручков Ю. В., Горбачева И. В., 2007, Шевченко Ю. Л., Ветшев П. С., Савенкова Н. Н., 2004).

В етіології даного захворювання в останні 10-15 років спостерігається зсув від грампозитивних мікроорганізмів у бік умовно-патогенних грамнегативних бактерій як типових збудників гнійно-септичних ускладнень. Серед флори, що виділяється з черевної порожнини при перитоніті, одне з провідних місць на сучасному етапі займає неклострідіальна анаеробна інфекція в асоціації з аеробними мікроорганізмами, серед яких, у свою чергу, перше місце займає кишкова паличка (Schaumann R., Blatz R., Beer J. et al., 2004, Ерюхин И.А., Шляпников С.А., 2006).

У випадках інфекцій, викликаних грамнегативними бактеріями, традиційна антибіотикотерапія виявляється недостатньо ефективною. Це пояснюється широким розповсюдженням штамів, які несуть плазміди множинної лікарської резистентності, асоціацією декількох видів мікроорганізмів, що викликають інфекційний процес і мають свій спектр чутливості до антибіотиків, або зміною збудника в процесі лікування. Для лікування важких ІАІ пропонуються різні схеми з використанням антимікробних препаратів широкого спектру дії у вигляді монотерапії або комбінованої терапії. Переважно це цефалоспорини ІІІ покоління у поєднанні з аміноглікозидами. Розглядають також використання карбапенемів і фторхінолонів у поєднанні з аміноглікозидами. На цей час в дослідженнях і узгодженнях щодо лікування ІАІ, немає однозначних рекомендацій відносно оптимального режиму антибактеріальної терапії (АБТ) як при позашпитальних, так і при нозокоміальних ІАІ (Салманов А. Г., Марієвський В. Ф., Бойко В. В. та інші, 2012, Anderson V. R., Perry C. M., 2008, Nicoletti G., Nicolosi D., Rossolini G. M., Stefani S., 2009).

Профілактичне застосування антибіотиків у плановій абдомінальній хірургії є важливим компонентом підвищення ефективності оперативного лікування і скорочення термінів перебування пацієнтів у хірургічній клініці. Однак, і до теперішнього часу застосування антибіотикопрофілактики має значну кількість важливих питань, на які ще не знайдено однозначних відповідей.

Останніми роками проводяться дослідження, які присвячені пошукам альтернативних і синергічних методів антимікробної дії. Одним з них є бактеріофаги (Górski A. et al., 2009).

Застосування бактеріофагів сьогодні є перспективним в умовах зростаючої антибіотикорезистентності збудників гнійно-септичних захворювань, інфекцій і ускладнення ран.

Тема дисертаційної роботи затверджена Проблемною комісією МОЗ, НАМН України зі спеціальностей вірусологія – 03.00.06 та мікробіологія – 03.00.07 (прот. № 137 від 29.04.2011 р.); вченою радою Харківського національного медичного університету (прот. № 5 від 18.05.2011 р.).

Для досягнення поставленої мети були сформульовані наступні завдання:

1. Визначити роль Escherichia coli в розвитку інтраабдомінальних інфекцій на основі ретроспективного аналізу захворюваності за 2000 – 2010 рр. в м. Харкові.

2. Вивчити біологічні властивості та рівень активності факторів патогенності (адгезивна, протеолітична, гемолітична) музейних та клінічних штамів Escherichia coli, які були виділені від хворих на перитоніт.

3. Розробити експериментальну модель перитоніту, спричиненого Escherichia coli.

4. Провести порівняльний аналіз антибіотикорезистентності клінічних та музейних штамів Escherichia coli.

5. Визначити чутливість музейних та клінічних штамів Escherichia coli, виділених від хворих на перитоніт до колі- та колі-протейного бактеріофагу.

6. Визначити в експерименті ефективність включення амікацину, гатифлоксацину, колі-фагу та колі-протейного бактеріофагу у комплексну терапію перитоніту.

Вперше встановлено, що комбіноване застосування гатифлоксацину з колі-фагом та колі-протейним бактеріофагом призводить до пригнічення росту Escherichia coli, усунення ознак мікробного запалення у тканинах паренхіматозних органів (печінка, селезінка, серце та листках очеревини), а також нормалізації лабораторних показників (гематологічних, гострофазових показників запалення і фагоцитарної активності лейкоцитів).

Вперше доведено, що імунобіологічні препарати (колі- та колі-протейний бактеріофаг) підвищують фагоцитарну активність лейкоцитів експериментальних тварин, як окремо так і в комбінації з гатифлоксацином.

Встановлено, що штами E. сoli, виділені від хворих на перитоніт, в порівнянні з музейними штамами, виявляють більш високу адгезивну, протеолітичну та гемолітичну активність. Вони відрізнялись від штамів групи порівняння полірезистентністю до антибіотиків, але при цьому, як і музейні штами, були високочутливими до колі- та колі-протейного бактеріофагу.

Встановлено велику кількість (85,7±9,3) % полірезистентних штамів E. coli, які ізольовані з черевної порожнини у хворих на перитоніт протягом 2011-2013 рр. у порівнянні з ретроспективними даними за 2000-2010 рр.

Практичне значення одержаних результатів. Удосконалено спосіб потенціювання дії антибіотиків з групи фторхінолонів. Використано прийом поєднання лікарських засобів для посилення дії одного препарату іншим та розроблено спосіб потенціювання дії антибіотиків із групи фторхінолонів шляхом додавання колі-протейного бактеріофагу. Ефективність способу доведена експериментально на підставі патоморфологічних досліджень, змодельованого перитоніту у мишей. Встановлено, що лікування експериментального перитоніту поєднанням діючої речовини гатифлоксацину з колі-протейним бактеріофагом є більш ефективним, ніж використання монотерапії з призначенням діючої речовини гатифлоксацину, що підтверджує потенціювання дії антибіотиків із групи фторхінолонів колі-протейним бактеріофагом.

Вищевикладене знайшло своє відображення в Інформаційному листі № 96 – 2013 «Спосіб потенціювання дії антибіотиків із групи фторхінолонів».

Пріоритетність досліджень підтверджено патентом України на корисну модель № 80884 «Спосіб потенціювання дії антибактеріальних препаратів з групи фторхінолонів», заявкою № u 201410637 «Спосіб моделювання гострого перитоніту» від 29.09.2014 р. Результати досліджень подано до реєстру галузевих нововведень за № 2789/05 від 10.11.2014 р. «Спосіб потенціювання дії протимікробних засобів із групи фторхінолонів».

Отримані результати впроваджені в практику хірургічного відділення КЗОЗ «Обласна дитяча клінічна лікарня №1» м. Харкова (акт впровадження від 11.02.13), гінекологічного відділення КЗОЗ «Міський пологовий будинок №1» м. Харкова (акт впровадження від 03.12.12), навчальний процес Одеського національного медичного університету (акт впровадження від 15.05.13), ДЗ «Дніпропетровська медична академія МОЗ України» (акт впровадження від 14.05.2013). Дослідження обґрунтовують перспективність використання комбінованого методу (застосування колі-протейного бактеріофагу з гатифлоксацином) для лікування перитоніту.

Персональний внесок автора у всіх опублікованих зі співавторами працях наводиться за текстом дисертації та в авторефераті у списку фахових публікацій.

У вступі означено актуальність проблеми лікування та профілактики післяопераційних гнійних ускладнень в абдомінальній хірургії в сучасних умовах, їх медична та соціальна значущість. Наведено основні причини неефективності сучасного лікування перитоніту. Обґрунтовано сутність мети та завдань досліджень, визначено зв΄язок роботи з державними науковими програмами, розкрито наукову новизну і практичне значення здобутих результатів, наведені дані щодо апробації отриманих результатів та впровадження їх в медичну практику, вказано структуру дисертації і її обсяг.

У першому розділі подано огляд літератури, який включає 4 підрозділи, викладено відомості щодо етіологічного фактору перитоніту, означено особливості патогенезу перитоніту, як запального процесу, обумовленого інтраабдомінальною інфекцією, проаналізовано епідеміологічний нагляд за розвитком антибіотикорезистеності, а також переваги та недоліки антибіотикотерапії та фаготерапії перитоніту.

У другому розділі наведено матеріали, методи і обсяг досліджень. Основний обсяг робіт виконано в лабораторії медичної мікробіології з Музеєм мікроорганізмів ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова НАМН України».

Ідентифікацію E.coli проводили згідно чинної нормативно – методичної документації. При дослідженні користувались селективними та диференційно – діагностичними середовищами, виробництва Hi Media, [India].

Приготування поживних середовищ здійснювалось у відповідності з вимогами (ГОСТ 10.444.1 – 84 (СТСЭВ 3833 – 82). – [Действителен от 1985-07-01]. – М. : Медицина, 1985).

Живильні середовища для вилучення та ідентифікації мікробів застосовували відповідно до особливостей культивування бактерій. Визначено чутливість E.coli до 30 хіміотерапевтичних препаратів (цефалоспорини; фторхінолони; аміноглікозиди; пеніциліни; тетрацикліни; поліміксини; нітрофурани; хлорамфенікол; ко-тримаксозол, визначали на середовищі Мюллер–Хінтон Hi Media, (India) з використанням стандартних комерційних дисків Hi Media, (India). Результати дослідження інтерпретували у відповідності до наказу Міністерства охорони здоров'я України № 167 від 05.04.2007 р. «Про затвердження методичних вказівок «Визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів». Адгезивні властивості вивчено згідно методики В. І. Бриліса із співавторами з використанням формалінізованих еритроцитів людини резус – позитивної 0 (І) групи крові (В.І. Бриліс, Т.А. Бриліс, А.А. Ланцер 1991).

Експерименти на тваринах виконано згідно Міжнародним рекомендаціям щодо проведення медико – біологічних досліджень з використанням тварин (Хроніка ВООЗ, 1985) та Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються з експериментальною та іншою науковою метою (Страсбург, 1980).

Статистичну обробку одержаних результатів здійснювали за стандартною методикою визначення середнього значення та його стандартного відхилення (М±m) і критерію Стьюдента. Достовірність різниці оцінювали при рівні вірогідності р<0,05. Статистичну обробку результатів здійснювали за допомогою прикладних комп΄ютерних програм з електронними таблицями Microsoft Excel 2003 та «Biostat-6».

У третьому розділі наведено дані ретроспективного аналізу, які представлені у табл.1.

Встановлено достатньо широкий спектр мікроорганізмів, який представлений 1021 ізолятами 20 видів мікроорганізмів. Слід відмітити, що серед збудників гнійно – запальних процесів органів черевної порожнини переважала грамнегативна мікрофлора (рис.1.). Лише при виразковій хворобі шлунка з ускладненням, частота грамнегативних мікроорганізмів була значно нижче і складала (6,2±1,0) %

Серед ентеробактерій при ІАІ найчастіше виділялись Escherichia coli (62,6±1,9) %. Мали місце поодинокі випадки виділення P.mirabilis, P. morganii, Enterobacter та Acinetobacter. З представників неферментуючих грамнегативних бактерій – P.aeruginosа, яка складала (25,0±1,7) %.

Встановлено, що серед представників грампозитивної мікрофлори, що були ізольовані з черевної порожнини, домінували мікроорганізми роду Staphylococcus. На їх частку припадало (59,2±3,7) % випадків.

Виділені мікроорганізми зустрічалися як в монокультурі, так і в асоціаціях. Мікроорганізми в монокультурі висівались в (85,0±1,4) % випадків.

Встановлено, що асоціації мікроорганізмів складали (15,3±1,2) %, на долю двокомпонентних асоціацій припадало (91,7±2,6) %, трьохкомпонентних– (8,3±8,7) %.

Грампозитивна мікрофлора була представлена родом Staphylococcus (S. aureus і S. epidermidis) та Enterococcus з домінуванням виду E. faecalis.

Встановлено, що частіше при перитоніті виділялись двокомпонентні асоціації – (78,0±5,6) %. На долю трьохкомпонентних асоціацій приходилось (22,2±5,6) % випадків.


Рис. 2. Співвідношення грампозитивної і грамнегативної мікрофлори при перитоніті
У четвертому розділі надано детальну характеристику біологічних властивостей та результати чутливості до протимікробних засобів, колі- та колі – протейного бактеріофагів музейних (19) та клінічних штамів E.coli, які були ізольовані з черевної порожнини хворих на перитоніт (50). При дослідженні біологічних властивостей встановлено, що штами були каталазопозитивні та оксидазонегативні, не мали здатності утилізувати цитрат Сімонса та гідролізувати сечовину, ферментували глюкозу з утворенням кислоти та газу, декарбоксилювали лізин. Але слід зазначити, що деякі штами характеризувались варіабельною біохімічною активністю. Досліджувані музейні штами E.coli утилізували ацетат, але не утилізували малонат; здатність до індолоутворення мали 10 (52,6±11,4) % з 19 штамів. При вивченні рухливості життєздатних колекційних штамів E.coli, встановлено, що із 19 штамів 3 (15,7±8,3) % зразки виявилися нерухливими.

Результати вивчення чутливості клінічних штамів до антибіотиків показали, що штами, виділені від дітей, мали 100 % чутливість до антибіотиків з групи карбапенемів (іміпенем і меропенем). Проявили виражену чутливість до цефалоспоринів 3 – го покоління (цефатоксим і цефтріаксон – 89,0±7,37 %) і 4 – го покоління (цефепім – 89,0±7,37 %). Високі показники чутливості відмічені до фторхінолонів (ципрофлоксацин – 89,0±7,37 %, офлоксацин, гатифлоксацин, норфлоксацин і левофлоксацин – по 83,0±8,85 %, пефлоксацин – 78,0±9,76 %).

Разом з тим клінічні штами E. coli виявили виражену стійкість до пеніцилінів, особливо, до ампіциліну (100 %) і в (50,0±11,7) % випадків до ампіциліну/клавуланату і амоксициліну. Високі показники резистентності відмічені до тетрацикліну– (72,0±10,58) % і доксицикліну – (89,0±7,37) %.

У штамів, ізольованих від дорослих хворих, виражена чутливість відмічалася тільки до карбапенемів: іміпенему – (93,0±6,8) % і меропенему – (78,5±10,9) %, в (50,0±13,3) % випадків відмічена чутливість до фурамагу.

До решти груп антибіотиків клінічні штами E. coli проявляли виражену стійкість.

У дітей 44,4 % штамів володіли полірезистентністю, у дорослих – 85,7 % штамів. У дітей виділено по 12,5 % штамів, які були стійкі до 2–х, 4–х і 5–и груп, 62,5 % – до 3 – х групп антибіотиків.

У дорослих виділено по 8,3 % клінічних штамів, які були стійкі до 2 – х, 3  – х і 6 – и груп антибіотиків, в 25,0 % виявлена резистентність до 5 груп і у 50,0 %–до 4 – х груп.

Враховуючи, що при перитоніті домінуючим мікроорганізмом є E.coli, який виявлявся в асоціації з представниками роду Proteus в (21±7,8) % випадків, нами були проведені дослідження чутливості мікроорганізмів не тільки до колі-фагу, а й до колі-протейного бактеріофагу.

При дослідженні чутливості отриманих штамів E.coli до колі-фагу та колі-протейного бактеріофагу, були отримані наступні результати.

Кількість чутливих штамів E.coli по відношенню до колі-фагу і колі-протейного бактеріофагу, які виділені від дітей хворих на перитоніт та музейні штами, була на одному рівні (60,0±9,8) % та (52,0±9,9) %. Як видно з табл. 2. кількість чутливих штамів E.coli, які були виділені від дорослих хворих на перитоніт, складала (80,0±8,0) % та (76,0±8,5) % і була достовірно нижче ніж в групі порівняння (92,0±5,4) %. Було проведено порівняння результатів, які отримали при застосуванні колі-фагу та колі-протейного бактеріофагу у штамів виділених від дітей, дорослих і музейних та не отримано достовірної різниці між показниками (р˂0,05).

Таким чином, можна зазначити, що для лікування перитоніту, який спричинений E.coli, можна використовувати як колі-, так і колі-протейний бактеріофаг.

Таблиця 2