ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Кормление свиней проводились с учетом возраста, живой массы и интенсивности использования в соответствии: ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма для свиней, ГОСТ 28001-88 Зерно фуражное и ОСТ 10125-96 Корма растительные.

Научно-исследовательская работа проведена по общей схеме исследования (рисунок 1). В опыте участвовало 12 хряков-производителей и 128 свиноматок крупной белой породы. Эксперименты проводили методом групп, который формировали по принципу аналогов с учетом возраста, живой массы и физиологического состояния животных.

В опытах проведенных Ленинградской области Российской Федерации использовали сперму хряков четырех пород: ландрас, дюрок, йокширская, и гемпшир+дюрок (ГД) в возрасте 8 месяцев - 2 –х лет, принадлежащих ЗАО «Русбелго» Гатчинского района Ленинградской области. Сперму получали мануально с помощью чучела при режиме использования 2-3 раза в неделю. При взятии спермы у хряков первую фракцию не использовали. Для осеменения использовали вторую и третью (не полностью) фракции. Подвижность сперматозоидов определяли при температуре 38-40ºС глазомерно и выражали в баллах от нуля до единицы. Сперму разбавляли средой BTS Pulver с гентамицином. Диализ спермы проводили в диализной камере, созданной в лаборатории воспроизводства и искусственного осеменения свиней ВНИИРГЖ. Сперма в диализной камере сохранялась при температуре 14-16 ºС в течение суток.

Подопытных животных кормили в соответствии с детализированными нормами, содержали в соответствии с принятой технологии регионов, обеспечивая требуемые нормативы микроклимата для хряков- производителей.

Качество эякулята оценивали по цвету, запаху, объему, концентрации, активности и абсолютному показателю переживаемости по общепринятым методикам и в соответствии с ГОСТ 20909.4. Определение подвижности спермиев и ГОСТ 20909.4. Определение выживаемости спермиев при температуре 37°С и Инструкциями [241].

Концентрацию сперматозоидов определяли в камере Горяева и выражали в млрд. на 1 мл спермы. Активность (процент поступательно-активных клеток) определяли микроскопированием капли семени при температуре 38...40С и выражали в баллах от 1 до 10, что соответствует 10-100 процента.

Время переживания (ВП) сперматозоидов определяли при постоянной температуре и выражали в часах. Все пробы опыта находились с колебаниями температуры в пределах не более 0,1С. Время учитывали от начала опыта до полного прекращения активности сперматозоидов, или до сохранения 3-5% подвижных сперматозоидов. Разбавление спермы хряков проводили в соответствии ГОСТ 17637-72. Среда глюкозо-хелато-цитратно-сульфатная для хранения спермы хряков.

Криоконсервацию спермы проводили по «Инструкции по технологии работы организаций по искусственному осеменению и трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных» [241].

Общее содержание сульфгидрильных групп в плазме спермы и отмытых дезинтегрированных сперматозоидах определяли методом амперометрического титрования [Kolthoff J.M., Harris W.E. [242], в модификации Прокопцев В.М., Мороз Л., Рустенов А.Р., [245], и колориметрическим методом при помощи 5,5-дитиобис (2-нитро-бензойной кислоты) [Торчинский Ю.М., [150].

Сохранность акросом оценивали методом фазово-контрастной микроскопии. Скорость движения сперматозоидов определяли по методике С.М.Ромбе и Г.А.Спиридоновой.

Для оценки целостности акросомы сперматозоидов свежеполученной спермы после хранения ее при плюсовых температурах, или на разных этапах обработки при криоконсервации и последующем оттаивании широко использовали микроскопию окрашенных препаратов спермы. Использовались карболэозином (Larsson К., Einarsson S., [129]) или метод фозово-контрастной микроскопии (Pursel V.G. et al., [27]; Е. Gracham et al., [16]; К. Larsson et al., [129].

Определении фосфор-кислородного соотношение измерение поглощения кислорода и неорганического фосфора проводили по М.Н.Кондрашовой и др. [124]. Параллельно с определением поглощения кислорода в пробах определяли убыль неорганического фосфата, количество которого вычисляли по разнице его в контрольной и опытной пробе. Содержание неорганического фосфора определяли по методу М.Н.Кондрашовой и др. [124].

Общую активность лактатдегидрогеназы определяли фенилгидразиновым калориметрическим методом. Определение изоферментного спектра лактатдегидрогеназы проводили методом электрофореза на агаре по Маркелову, в модификации (Л.Г. Мороз и др. [246]. Активность цитохромоксидазы (ЦХО) определяли реактивом НАДИ по Шергину [35].

Активность дегидрогеназ определяли по времени обесцвечивания метиленовой сини по Н.П. Шергину [35], в модификации Л.Г. Мороз и др. [233]. Анализ активности ферментов аспаргиновой (АСТ) и аланиновой (АЛТ) трансаминаз в сперме хряков проводили по модифицированному методу Умбрайта.

Криоконсервацию спермы проводили на фторопластовой пластине в парах жидкого азота при температуре на пластине -85С. Оттаивали замороженную сперму с помощью гидрооттаивателя конструкции ВИЖа (В.К.Кононов и др., [101].

Схема исследований

Запись режима охлаждения спермы при замораживании осуществляли с помощью медь-константановой термопары ипотенциометра КСП-4.

Температурный (холодовой) шок сперматозоидов вызывали погружая флаконы с 3 мл спермы в воду с температурой 0 - 2С.

Проверку оплодотворяющей способности сперматозоидов хряков проводили на свиноматках хозяйств «Достык», «Дидар» и «Аксункар» Южно-Казахстанской области. Свиноматок в охоте выявляли два раза в сутки с помощью хряка пробника. Осеменяли свиноматок двукратно, через 12 и 24 часа после выявления рефлекса неподвижности. Доза спермы для однократного осеменения содержала 3 млрд. поступательно подвижных сперматозоидов (ГОСТ 27775-88 Искусственное осеменение сельскохозяйственных свиней).

Результаты экспериментальных исследований обрабатывали методами вариационной статистики по Е.К, Меркурьевой [243].

Эякулированная, или «цельная» сперма хряков производителей представляет собой суспензию сперматозоидов в семенной плазме. Спермии образуются в семенниках в результате сперматогенеза, а семенная плазма, представляющая собой смесь секретов, продуцируется придаточными железами. У хряков 94-95% составляет вода, остальные 5-6% сухое вещество. Сперма хряков отличается высоким содержанием редуцицирующих сахаров, эрготионеина и инозита. По данным Т. Маnnа [34] эрготионеин – соединение тиоловой природы содержащие сульфгидрильные группы (SН-), выполняет роль естественного антиокислителя в экуляте, а также роль метаболического регулятора в энергетическом обмене.

Сперматозоиды хряков - это высокоспециализированные клетки, состоящие из головки, шейки, тела и хвоста, каждый из которых выполняет свою определенную функцию и имеет свои особенности строения. Нарушения функционирования любого отдела спермиев приводит к нарушению основной функции сперматозоидов - оплодотворения яйцеклеток. При этом 82,6% сухого вещества гамет самцов составляет белок, в них имеются многочисленные дисульфидные (-S-S-) связи.

Роль сульфгидрильных групп (SН-) низкомолекулярных тиолов и белков в сперме хряков обусловлена их участием в сложных биохимических процессах, обеспечивающих сперматозоиды энергией и создающих условия для процесса оплодотворения.

В настоящее время насчитывается свыше 100 ферментов, активность которых тормозится при блокировании содержащих в них SН-групп. Такие ферменты получили название тиоловых. Среди них имеются представители всех классов ферментов, катализирующих самые разнообразные химические превращения происходящих в клетке.

Методом ампериметрического титрования азоткокислым серебром нами изучено физиологический уровень SН-групп в эякуляте хряков производителей, а также связь концентрации сульфгидрильных групп в сперме с ее качественными показателями.

От 12 хряков крупной белой породы проведены исследования 59 эякулятов и установлено, что в 100 мл плазмы спермы содержится в среднем 67,3 мкмоль с колебаниями от 6 до 200 мкмоль сульфгидрильных групп. Результаты исследования представлены в табл.1. Как видно из таблицы у 32,2% эякулята в 100 мл плазмы спермы содержится 41-60 мкмоль сульфгидрильных групп, соответственно – у 23,8% 61-80 мкмоль, у 11,8% - 81-100 мкмоль SН-групп.

Изучено влияние интенсивности использование самцов на содержание SН-групп в плазме спермы. Установлено, что при переводе хряков на интенсивное использование параллельно с ухудшением качества спермы происходит резкое снижение концентрации SН-групп в плазме. При переводе хряка №213 на ежедневное использование в первом эякуляте было 52 мкмоль, во втором - 46 мкмолей, в третьем - 46 мкмолей и в четвертом - 31 мкмолей сульфгидрильных групп на 100 мл плазмы. Возврат к умеренному режиму использования привело к постепенному восстановлению исходного уровня SН-групп.

Таким образом, наши эксперименты показали интенсивное использование самцов приводит не только к снижению качественных показателей, но и снижению уровня SН-групп плазмы спермы самцов. Отсюда следует, что видимо имеется определенная взаимосвязь между уровнем SН-групп плазмы и качественными показателями эякулята.

Изучено влияние сезонна года на содержание SН-групп плазмы спермы. Установлено, что в весенне-летний период концентрация SН-групп в плазме спермы выше на 24-29%, чем в осенние и зимние периоды года.

Аналогичные исследования по изучению содержанию сульфгидрильных групп в сперматозоидах проведены на 59 эякулятах хряков производителей. Эти данные по исследованию SН-групп в сперматозоидах представлены в таблице 2.

Как видно из табл.2 содержание SН-групп в 10 млрд. сперматозоидов находится в пределах от 5,1 до 19,0 мкмоль, а в среднем составляет 8,7 мкмолей. Только у 3,4% хряков производителей содержание SН-групп на 10 млрд. сперматозоидов выше 15,1 мкмоль. У 15,2% производителей в 10 млрд. сперматозоидов содержится 5,1-7,0 мкмоль, соответственно у 25,4% - 7,1-9,0 мкмоль, у 32,2% хряков 9,1-11,0 мкмоль и 17,0% - 11,1-13,0 мкмоль SН-групп в 10 млрд. сперматозоидах.

Таким образом, в сперме хряков содержится значительное количество сульфгидрильных групп (SН-) низкомолекулярных тиолов и белков, которые по-видимому участвуют в сложных биохимических процессах протекающих клетках, а также в сохранении структурных элементов клетки, мембраны гамет и качественных показателей сперматозоидов.
3.1.2 Влияние низкомолекулярных тиоловых соединений на дегидрогеназную активность и абсолютный показатель живучести сперматозоидов

В настоящее время в сперматозоидах выявлены различные дегидрогеназы, участвующие в окисление субстратов цикла Кребса: сукцинатдегидрогеназа, пируватдегидрогеназа, дегидрогеназа яблочной и α-кетоглютаровой кислот. Кроме того, установлена активность α-глицерофосфатдегидрогеназы и полиалкоголь- дегидрогеназы, что свидетельствует об утилизации в спермиях глицерина и многоатомных спиртов – сорбитола и ионизитола. Учитывая, что в метаболизме гамет самцов активно принимают участие тиоловый фермент – дегидрогеназа, проведено изучение влияния низкомолекулярных тиоловых соединений на изменение ферментативную активность спермы хряков-производителей.

Восстановленный глутатион использовали в концентра­циях от 6,5 · 10-⁴ до 3,3 · 10-² М. Г -SН в концентраци­ях 6,5 · 10-⁴ - 1,6 · 10-³ М почти не влияет на подвиж­ность и переживаемость гамет самцов. По мере увеличения концентрации Г - SН переживаемость сперматозоидов за­метно снижается и при концентрациях, равных 2,6 · 10-² - 3,3 · 10-² М, движение сперматозоидов быстро прекраща­ется и они погибают.

Активность дегидрогеназ (табл.4) повышается при использова­нии реагента в концентрациях 6,5· 10-⁴ - 2,6 · 10-² М. При концентрации 1,6 · 10-² М активность дегидрогеназ увеличивается более чем в два раза по сравнению с конт­ролем. Повышение концентрации Г - SН до 3,3 · 10-² М приводит к снижению дегидрогеназной активности почти в 2 раза по сравнению с исходным уровнем.

Для выяснения вопроса о возможности проникновения восстановленного глутатиона через мембрану сперматозоидов, нами определены со­держание SН-групп в отмытых сперматозоидах до и после добавления реагента методом амперометрического тит­рования (табл. 4).

Из таблицы 4 видно, что добавление восстановленного глутатиона вызывает некоторое увеличение числа SН-групп в сперматозоидах, осо­бенно это заметно через 9 и 24 часа инкубации исследуемых образцов. Эти данные показывают, что восстановленный глютатион медленно проникает через мембрану сперматозоидов.