Эколого-биологическое обоснование применения лечебно-профилактического препарата на основе гриба-ксилотрофа trametes pubescens (shumach: fr) pilat. В отношении энтерогеморрагической кишечной палочки 03. 02. 08 экология

КАЛИНОВИЧ Арсений Евгеньевич

ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ГРИБА-КСИЛОТРОФА TRAMETES PUBESCENS (SHUMACH:.FR) PILAT. В ОТНОШЕНИИ ЭНТЕРОГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Иркутск 2013
Работа выполнена на кафедре анатомии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО ИрГСХА
Научный руководитель: доктор биологических наук,
Чхенкели Вера Александровна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Огарков Борис Никитович

доктор биологических наук

Попкова Софья Марковна

Ведущая организация: ФБГОУ ВПО «Иркутский государственный технический университет »
Защита диссертации состоится: 24 декабря 2013 г. В 10:00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.074.07 при ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный университет» по адресу 664003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, ауд. 219.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИГУ по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Бульвар Гагарина, 24

Отзывы просим присылать ученому секретарю диссертационного совета по адресу 664003, г. Иркутск, ул. Карла Маркса 1, биолого-почвенный факультет ИГУ. Тел. / факс (3952)421855; e-mail: dissovet07@gmail.com

Автореферат разослан: 23 ноября 2013 года
Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат биологических наук

доцент А.А Приставка

Возбудители инфекционных заболеваний являются достаточно значимым экологическим фактором, особенно в условиях искусственной экосистемы, какой является животноводческая ферма (С.И. Джупина, 1991, 2009). Стойловое содержание животных способствует их тесному контакту в ограниченном пространстве, что способствует распространению инфекционных заболеваний, многолетней циркуляции возбудителей, а также приобретению болезнетворными бактериями множественной резистентности к применяемым антимикробным препаратам (Д.Н. Уразаев, 2002). Современная система животноводства, предполагающая, как и любой другой бизнес, извлечение максимальной прибыли при минимальных затратах, не предполагает использования дорогостоящих эффективных антимикробных препаратов в системе борьбы с инфекциями, что делает затруднительной девастацию возбудителей и требует разработки и внедрения недорогих и эффективных антимикробных препаратов (В. А. Чхенкели, 2006; Л.И. Макарец, 2009).

В виду того, что энтерогеморрагическая кишечная палочка серотипа O157:H7 имеет не только эпизоотологическую значимость, но и эпидемиологическую, т.к. в плследние десятилетия вспышки острого геморрагического колита у людей регистируются во многих странах мира, проблема её распространения привлекает всё больший интерес ученых. При попадании в окружающую среду E. coli O157:H7 может стать причиной эпидемии острого геморрагического колита, который характеризуется как острым течением болезни, так и серьезными осложнениями (W. F Clark, 2010; В.П. Топорков, 2011).

В настоящее время немаловажная проблема заключается в недостаточности методических материалов по индикации и диагностике энтерогеморрагических эшерихий в ветеринарии, а также отсутствии мониторинговых исследований в хозяйствах нашего региона. Разработанные и успешно применяемые в крупных ветеринарных центрах методы ПЦР и ИФА требуют использования стационарного дорогостоящего оборудования, их внедрение на молочно-товарных фермах не целесообразно и не оправдано с различных точек зрения. Однако без достаточного контроля на уровне хозяйств, может оказаться незамеченной вспышка эпизоотии, вызванная ЭГКП серотипа O157:H7, а при проникновении возбудителя в продукты переработки животноводства, или водоемы возрастает и эпидемическая опасность. Исходя из этого, была усовершенствована методика индикации и диагностики энтерогеморрагической кишечной палочки серотипа О157:Н7 в ветеринарии.

При этом, в последние десятилетия все больше внимания ученых привлекают базидиальные грибы и биологически активные вещеста (БАВ), синтезируемые ими. Так, в работах В.А. В.А. Чхенкели (2006), Е.С. Горшиной (2002), Г. К. Ковалёвой (2009), показана достаточно высокая антимикробная и лечебно-профилактическая эффективность препаратов, полученных на основе грибов-ксилотрофов рода Trametes. Особый интерес для целей данного исследования представляет новый полифунциональный препарат траметин, разработанный в Иркутском филиале Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии, так как его прототип – антимикробный препарат Леван-2 – показал сравнительно высокую антимикробную активность, в том числе и по отношению к полирезистентным штаммам различных микроорганизмов (В.А. Чхенкели, 2009, 2010), и в системе борьбы с колибактериозом телят. При исследовании траметина в первую очередь следует рассмотреть характер взаимоотношения гриба-продуцента и микроорганизмов, в том числе и представителей семейства Enterobacteriaceae. Такое исследование даст возможность понять природу и механизм антимикробной активности продуцента, изучив его состав, обнаружить факторы, способные ее повысить с точки зрения биотехнологии.

В процессе производства препарата закономерно встает вопрос об утилизации отходов биотехнологического производства. Метод жидкофазной ферментации способствует постоянному накоплению биомассы гриба-продуцента, которую можно использовать в качестве кормовой добавки для скота, как и предлагалось в технологическом регламенте. Однако чтобы такой метод утилизации отходов приобрел значимую экономическую целесообразность, необходимо производить колоссальное количество биомассы продуцента, что не соотносится с потребностью региона в ветеринарных антимикробных препаратах.

Цель работы заключается в выявлении эколого-биологических аспектов, определяющих антимикробную активность препарата траметин в отношении энтерогеморрагической кишечной палочки, и в разработке альтернативной схемы утилизации отходов его производства.

Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:

1. 
   Определить характер взаимоотношений гриба-ксилотрофа T. pubescens и микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae. Изучить природу биологически активных веществ, определяющих антимикробное действие препарата траметин на микроорганизмы данного семейства.
   
2. 
   Усовершенствовать методику индикации и диагностики ЭГКП серотипа О157:Н7 в ветеринарии и выделить изоляты E.coli серотипа O157:H7 от крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах.
   
3. 
   Изучить устойчивость/чувствительность изолятов к современным антимикробным препаратам, и изучить in vitro антимикробную активность препарата траметин в отношении изолятов E. coli O157:H7.
   
4. 
   Разработать альтернативную схему утилизации биомассы гриба-продуцента как отхода производства препарата траметин, изучить возможность использования биомассы T. pubescens в качестве основы для приготовления питательных сред, пригодных для культивирования микроорганизмов рода Bacillus.
   

1. 
   На обследованных молочно-товарных фермах циркулируют ЭГКП серотипа O157:H7, проявляющие полирезистентность к антимикробным препаратам, применяемым в животноводческих хозяйствах, что является значимым экологическим фактором.
   
2. 
   Гриб-ксилотроф Trametes pubescens (Shumach:.Fr.) Pilat. проявляет ярко выраженную антагонистическую активность в отношении бактерий семейства Enterobacteriaceae, а препарат траметин, разработанный на его основе, проявляет высокую антимикробную активность in vitro относительно энтерогеморрагической кишечной палочки серотипа O157:H7.
   
3. 
   Культуральный мицелий гриба T. pubescens, который является отходом производства препарата траметин, представляет полноценную основу питательной среды для культивирования бактерий рода Bacillus, а также может служить основой для разработки питательных сред для культивирования других бактерий.
   

Впервые на молочно-товарных фермах Иркутской области были выделены ЭГКП серотипа O157:H7, изучена их устойчивость/чувствительность к современным антимикробным препаратам, показана их полирезистентность. Впервые установлена in vitro высокая антимикробная активность препарата траметин в отношении изолятов ЭГКП E. coli O157:H7. Впервые проведено сравнительное исследование состава замещенных ароматических соединений в препаратах на основе гриба-ксилотрофа T. pubescens.

Полученные данные являются фрагментом проведения доклинических исследований препарата траметин, который будет использоваться в системе борьбы с желудочно-кишечными болезнями молодняка крупного рогатого скота.

Практическая значимость полученных результатов

Усовершенствована методика индикации и диагностики ЭКГП серотипа О157:Н7 для использования в ветеринарных исследованиях. Предложены современные методы, позволяющие быстро и эффективно диагностировать колибактериоз, этиологическим фактором которого являются ЭГКП серотипа O157:H7. В работе обоснована экономическая эффективность применения данных методик в животноводческих хозяйствах.

Предложен альтернативный способ утилизации отходов производства препарата траметин, который является экологичным, экономически привлекательным и достаточно перспективным в плане практического применения. Разработана методика приготовления питательных сред на основе ферментолизата биомассы базидиомицетов, которая может быть применена в качестве аналога при проведении подобных исследований.

Реализация и внедрение результатов исследования

Теоретические положения, результаты исследования и рекомендации использованы при выполнении НИР и ОКР по теме № 01.2.00 900998 «Оптимизация диагностических, профилактических и терапевтических мероприятий по борьбе с инфекционными и инвазионными заболеваниями животных в современных экологических условиях Восточной Сибири» (2008-2012 гг.), выполнявшейся на кафедре анатомии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия», научный руководитель – д.б.н. В.А. Чхенкели; по государственному контракту № 2012.41773 от 16 мая 2012 г. с Министерством сельского хозяйства Иркутской области «Усовершенствование методов индикации и диагностики энтерогеморрагической кишечной палочки», научный руководитель – д.б.н. Чхенкели В.А; по теме №01201355870 «Усовершенствование методов диагностики, профилактики и лечения в системе борьбы с желудочно-кишечными и респираторными болезнями телят в современных условиях АПК Иркутской области» (2013 -2017 гг.), выполняющейся на кафедре анатомии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО ИрГСХА, научный руководитель – д.б.н. Чхенкели В.А.

Основные результаты диссертационного исследования представлены на региональных, всероссийских и международных конференциях, семинарах и конкурсах: Региональной научно-практической конференция молодых ученых «Научные достижения производству» (Иркутск, 2011); Конкурсе молодых ученых в рамках XXV международной зимней школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», посвященной 30-летию Научно-образовательного центра ИБХ РАН (Москва, 2013); Научно-практическом семинаре, посвященном «Дню аспиранта ИрГСХА» (Иркутск, 2013); VI Всероссийском молодежном научно-практическом конгрессе с международным участием «Симбиоз-Россия 2013» (Иркутск, 2013); IV Межрегиональном семинаре «Организация санитарно-эпидемиологического мониторинга за инфекционными заболеваниями» (Иркутск, 2013); III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Развитие физико-химической биологии и биотехнологии на современном этапе», посвященной 35-летию кафедры физико-химической биологии ИГУ и 95-летию Иркутского государственного университета (Иркутск, 2013).

Обоснованность научных положений, выводов и рекомендаций, сформулированных в диссертации, подтверждается сопоставлением полученных экспериментальных данных с данными других учёных как российских, так и зарубежных, полученными в работах по изучению распространения ЭГКП у крупного рогатого скота, разработке новых методов индикации и диагностики ЭГКП серотипа О157:Н7 в ветеринарии, разработке мер борьбы с возбудителем колибактериоза телят с использованием препаратов на основе грибов – ксилотрофов, обсуждением на научно – практических конференциях регионального, Всероссийского и международного уровня по микробиологии, экологии, биотехнологии, ветеринарии; публикациями основных положений диссертационного исследования в рецензируемых журналах, в том числе из перечня рекомендуемых ВАК журналов для защиты кандидатских и докторских диссертаций («Сибирский медицинский журнал, «Вестник ИрГСХА»).

По результатам исследования опубликовано 16 научных работ, из них 14 - статьи, из которых 3 - в изданиях из списка ВАК, 1 - в электронном издании; 1 методические рекомендации; 1 заявка на изобретение.

Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы и 2 приложений. Работа изложена на 161 странице, содержит 19 таблиц и 9 рисунков. Список литературы включает 172 наименования, из которых 102 – российские, 66 – зарубежные издания, 4 интернет-сайта.

Выражаю глубокую признательность научному руководителю – д. б.н. Вере Александровне Чхенкели за теоретическую и методическую помощь в организации и проведении исследований, внедрении результатов исследования, организации поездок в хозяйства Иркутской области и на научные форумы, За помощь в проведении микроскопических исследований благодарю д.б.н. Елену Валентиновну Лихошвай и сотрудников отдела ультраструктуры клетки ЛИН СО РАН, за помощь в проведении исследований - Татьяну Иннокентьевну Барыкину - ветеринарного врача бактериологического отдела Иркутской межобластной ветеринарной лаборатории и Татьяну Николаевну Малову – химика-токсиколога отдела токсикологии и биохимии ФГБУ ИМВЛ. Отдельную благодарность выражаю начальнику отдела аспирантуры ИрГСХА Шеметовой Инне Сергеевне за всестороннюю информационную поддержку. Благодарю также Хамидуллину Зою Валерьевну и Кузнецова Алексея Валерьевича за помощь в техническом оформлении диссертации и моральную поддержку. Особую благодарность приношу своим родным за оказанную моральную и финансовую поддержку.

В обзоре литературы приведены современные данные об эпидемиологической, эпизоотологической и экологической значимости энтерогеморрагической кишечной палочки как возбудителя кишечных инфекций человека и животных, а также как микроорганизма-индикатора загрязнения окружающей среды. В главе 1 приведены данные по экологии грибов-ксилотрофов рода Trametes, рассмотрены особенности культивирования высших базидиальных грибов, принципы получения и использования БАВ грибов рода Trametes в медицине и ветеринарии. Далее рассмотрены механизмы действия некоторых антимикробных препаратов. В заключении изложены технологические особенности утилизации культурального мицелия гриба-продуцента T. pubescens – отхода биотехнологического производства, а также приведены рецепты приготовления питательных сред.

В работе использовали комплексный эпизоотологический подход для мониторинга ситуации по колибактериозу крупного рогатого скота в регионе. Были проанализированы ветеринарные статистические отчеты районных ветеринарных лабораторий за период с 2006 по 2010 г., отчеты ФГБУ «ИМВЛ» (форма 4–вет) с 2006 по 2011 г.; ветеринарная отчетность Службы ветеринарии Иркутской области.

Для изучения причин желудочно-кишечных болезней новорожденных телят проводили бактериологическое исследование материала от живых животных согласно МУК №13-7-2/2117 Методические указания по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных» (2000) и МУК №13-7-2/1759 «Методические указания по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями» (1999). Выделение и идентификацию E. coli O157:H7 проводили в соответствии с МУК 4.2.992 - 00 «Методы выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E. сoli О157:Н7» (2000). Для выделения штаммов E. сoli О157:Н7 использовали отечественную среду «Сорбитол E. coli 0157:Н7» (питательная среда для выделения и дифференциации E. coli 0157:Н7 и других энтеробактерий по признаку ферментации сорбита) производства ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии (г. Оболенск)

Для биохимической идентификации использовали пластины биохимические, дифференцирующие энтеробактерии (ПБДЭ) производства ООО «Диагностические системы» (г. Н. Новгород) согласно инструкции по использованию, которые позволяют проводить идентификацию по 20 признакам.

Для определения токсичности выделенных штаммов проводили биопробы на белых беспородных мышах. Для подготовки суспензии культуры выращивали в чашках Петри на триптозном ГРМ-агаре, с добавлением 90 мкг/мл линкомицина. Через 18-20 ч инкубирования в термостате при температуре 37 ^оC культуру смывали физиологическим раствором в объеме 3 мл. В каждую пробирку с суспензией добавляли по 7,5 мг полимиксина В и тщательно перемешивали в течение 10 мин. Обработанную микробную взвесь центрифугировали при 3000 об. /мин в течение 30 мин. Таким образом получали супернатанты для обнаружения веротоксинов. Для определения наличия веротоксинов для каждой культуры брали по 2 мыши весом 16-18 г. Одной мыши вводили по 1 мл супернатанта, а другой – контрольной – по 1 мл прокипяченного в течение 45 мин. супернатанта. При положительном результате мыши погибали через 10-12 ч. При вскрытии мышей наблюдали патологические изменения в толстом кишечнике, характеризующиеся явлениями гемоколита (отек слизистой оболочки, эритемы, геморрагии). Мыши, которым вводили прокипяченные суспензии бактерий, остались живы (В.А. Чхенкели, 2013).

Экспериментальные данные обрабатывали статистически с использованием компьютерных программ Microsoft Office Excel 2003, «Statistica 6.0». Статистическую обработку результатов экспериментов и оценку достоверности проводили по критерию Стьюдента для уровня вероятности не менее 95 %.