Лабораторная медицина №6

Назаренко Г.И., Кишкун А.А., Миколаускас В. П. Арсенин С.Л.

Диагностика антифосфолипидного синдрома

 
Антифосфолипидный синдром (АФС) относится к группе ревматических заболеваний и характеризуется наличием аутоантител к фосфолипидам. Причины формирования аутоантител точно не установлены. Полагают, что большинство вирусов человека тропны к эндотелию сосудов. Персистируя в них, вирусы вызывают морфологические и функциональные изменения клеток; происходящее при этом разрушение основной мембраны стенок сосудов, обусловленное повреждением эндотелия, ведет к активации XII фактора Хагемана свертывающей системы крови и развитию гиперкоагуляции, а также выработке аутоантител. Аутоантитела блокируют белки мембраны эндотелия (протеин С, S, аннексины, тромбомодулин), которые препятствуют тромбообразованию, подавляют активацию компонентов коагуляционного каскада, ингибируют продукцию антитромбина III и простациклина, оказывают непосредственное повреждающее действие на эндотелиальные клетки сосудов. Взаимодействие антител с фосфолипидами клеточных мембран приводит к конформационным и метаболическим изменениям в мембранах, нарушению функции клеток, стазу крови в капиллярах и венулах, тромбозу [3]. Выделяют несколько клинических вариантов АФС, которые с учетом частоты встречаемоcти располагаются в следующем порядке:

1)       вторичный АФС, ассоциированный с системной красной волчанкой (СКВ) и другими заболеваниями, в первую очередь системными;

2)       вторичный АФС у больных с волчаночноподобными проявлениями;

3)       первичный АФС;

4)       «катастрофический» АФС (острая диссеминированная коагулопа-тия/васкулопатия) с острым полиорганным тромбозом

5)       другие микроангиопатические синдромы (тромботическая тромбо-цитопеническая пурпура/гемолитико-уремический синдром), HELLP-синдром (наличие беременности в сочетании с гемолизом, повышением активности печеночных ферментов, снижением содержания тромбоцитов), ДВС-синдром, гипопротромбический синдром;

6)       «серонегативный» АФС.

У одних больных АФС проявляется преимущественно венозными тромбозами, у других – инсультом, у третьих – акушерской патологией или тромбоцитопенией. Частота выявления АФС при различных патологических состояниях представлена в табл. 1.

 

Таблица 1.

Антитела к фосфолипидам представляют собой гетерогенную популяцию, реагирующую с отрицательно заряженными (кардиолипин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол и фосфатидные кислоты), реже нейтральными (фосфатидилэтаноламин) фосфолипидами и/или фосфолипидсвязывающими сывороточными белками (b-2-гликопротеин 1, аннексин V, протромбин) [13]. Наиболее часто в клинике для диагностики АФС используют определение антител к кардиолипину и обнаружение волчаночного антикоагулянта. Гораздо реже исследуют уровень специфических антител к фосфатидилсерину, фосфатидилинозитолу и фосфатидилэтаноламину, а также к b-2-гликопротеину 1, аннексину V и протромбину.

Критерии диагностики антифосфолипидного синдрома были сформулированы в октябре 1998 на VIII Международном симпозиуме по антителам к фосфолипидам в Саппоро (Япония) и представлены в табл. 2 [24].

Таблица 2. Клинические и лабораторные критерии диагностики АФС

Нарастание уровня антител является чувствительным и специфическим лабораторным тестом, характеризующим риск возникновения тромботических осложнений. Больные, у которых обнаружен повышенный уровень антител к кардиолипину, относятся к группе риска по возникновению тромбозов при различных заболеваниях. При беременности из-за тромбоэмболических повреждений трофобласта и плаценты возможны гибель плода, выкидыш, отслойка плаценты, гипотрофия и гипоксия плода. В США частота выявления аутоантител к фосфолипидам у населения составляет 5 %. Если его обнаруживают в крови у беременных, то без лечения у 95 % наблюдается выкидыш и/или гибель плода. У нас в стране частота обнаружения антител к кардиолипину у пациенток с привычным невынашиванием беременности составляет 27,5–31%, и практически у всех обнаруживают вирусоносительство [3].

При диагностике АФС определяются антитела класса IgG, IgA и IgМ. Более часто встречаются при АФС антитела к кардиолипину класса IgG и IgA, чем класса IgМ (табл. 3).

 

Т а б л и ц а 3. Частота выявления классов антител к кардиолипину

Уровень антител к кардиолипину в крови может колебаться как спонтанно, так и в ответ на какие-то патологические процессы в организме. При лечении АФС концентрация антител к кардиолипину может меняться, а может оставаться на прежнем уровне. Антитела класса IgМ наиболее быстро реагируют (их уровень снижается) на эффективное лечение АФС. Низкие уровни антител к кардиолипину класса IgМ могут быть обнаружены при ревматоидном артрите, синдроме Шегрена, лекарственно-индуцированной красной волчанке, болезни Лайма и сифилисе.

Антитела к кардиолипину могут быть выявлены при следующих заболеваниях: тромбоцитопениях, гемолитической анемии, аутоиммунных заболеваниях, системной красной волчанке, ревматоидном артрите, ревматизме, узелковом периартериите, инфаркте миокарда, инсульте, нестабильной стенокардии, инфекциях (туберкулез, лепра, стафилококковая, стрептококковая инфекции, корь, мононуклеоз, краснуха, СПИД), артериальной гипертензии, облитерирующем эндартериите, системном атеросклерозе, угрозе развития тромботических осложнений, акушерской патологии с развитием АФС. Относительный риск развития инсультов, выкидышей или тромбозов глубоких вен у больных, имеющих в крови антитела к кардиолипину, в 2–4 раза выше, чем у пациентов, у которых они отсутствуют.

Антитела к фосфатидилсерину аналогично антителам к кардиолипину, взаимодействуют с фосфолипидами мембран тромбоцитов и эндотелиальных клеток сосудов, вызывая их повреждение, что служит основой для развития тромбозов и тромбоэмболий. Фосфатидилсерин, еще один представитель класса фосфолипидов, входит в состав клеточных мембран различных тканей. Наибольшее количество фосфатидилсерина содержат мембраны тромбоцитов и эндотелиальных клеток сосудистой стенки, участвующие в свертывании крови.

В качестве «cutoff” для антител класса IgG к фосфатидилсерину в сыворотке используют значения 16, IgM – 22 и IgА – 20 фосфатидилсериновых единиц [13]. Специфичность определения антител класса IgM и IgG к фосфатидилсерину в здоровой популяции составляет 96 %, IgА – 95 %. Антитела класса IgM к фосфатидилсерину обнаруживают у 25 %, IgG – у 22,2 %, IgA – у 11,1 % больных с СКВ. У пациентов с первичным АФС повышенный уровень антител класса IgM к фосфатидилсерину выявляют в 54,5 %, IgG – в 90,9 %, IgA – в 36,4 % случаев. При СКВ без наличия тромбозов в анамнезе или тромбоцитопении повышенный уровень антител класса IgM и IgG к фосфатидилсерину выявляют у 11,1 % больных, а уровень IgA у всех пациентов остается ниже значений “cutoff” [13].

Волчаночный антикоагулянт. (ВА) относится к иммуноглобулинам класса IgG и представляет собой гетерогенную группу антител против отрицательно заряженных фосфолипидов. Свое название он получил в связи с тем, что оказывает влияние на фосфолипидзависимые коагуляционные тесты и впервые был выявлен у больных с СКВ. Уровень волчаночного антикоагулянта в плазме в норме – 0,8–1,2 усл. ед. Наличие ВА у больных можно заподозрить при необъяснимом удлинении АЧТВ, коагуляционных тестов со змеиным ядом, времени рекальцификации и в меньшей степени протромбинового времени при всех других нормальных показателях коагу-лограммы. ВА обычно обнаруживают по удлинению у больных АЧТВ, при этом они не имеют выраженных проявлений кровоточивости, в то же время у 30 % из них может развиваться тромбоз, т.е. имеется парадоксальная реакция – удлинение АЧТВ и развитие тромбоза. Механизм возникновения тромбоза у больных с ВА точно не установлен, однако известно, что антитела к фосфолипидам снижают продукцию простациклина эндотелиальными клетками за счет ингибирования фосфолипазы А₂ и протеина S и, таким образом, создают предпосылки к тромбообразованию. В настоящее время ВА рассматривается как значительный фактор риска у больных с необъяснимыми тромбозами и часто обнаруживается при различных формах патологии, особенно при системных, аутоиммунных заболеваниях, АФС, у больных СПИДом (у 20–50 % больных), у женщин с привычными выкидышами и внутриутробной гибелью плода, у больных с осложнениями лекарственной терапии. Около 25–30 % пациентов с ВА имеют тромбоэмболии. Эпизоды церебральной ишемии могут быть результатом кардиоэмболии, развивающейся у пациентов с циркулирующим в крови ВА. ВА и антитела к кардиолипину обнаруживаются одновременно у 70 % больных с АФС [9]. ВА выявляется при СКВ у 34–44 % больных [17], а среди больных, длительно получающих фенотиазин, – у 32 %. Частота выявления ВА лучше коррелирует с тромбозами у больных, чем частота выявления антител к кардиолипину.

Антитела к фосфолипидам являются одной из причин ишемических нарушений мозгового кровообращения, особенно у лиц молодого возраста. По данным литературы антитела к фосфолипидам выявляют у 2,4–46 % больных молодого возраста с ишемическими нарушениями мозгового кровообращения [8]. Из всех больных с антителами к фосфолипидам антитела к кардиолипину обнаруживают у 60 % больных, волчаночный антикоагулянт у 75 % [2]. Одновременно те и другие типы антител выявляют в 50–75 % случаев. Нарушения мозгового кровообращения, ассоциирующиеся с выработкой антител к фосфолипидам, имеют ряд клинических особенностей. Как правило, они начинаются в молодом возрасте (чаще заболевают женщины) и имеют тенденцию к рецидивированию. Рецидивы отмечают 35–70 % больных с ишемическими инсультами [11], поэтому таким больным показано не только длительное лечение антиагрегантами и антикоагулянтами непрямого действия, но и динамический контроль за уровнем антител к фосфолипидам.

Определение ВА и антител к кардиолипину для диагностики АФС показано всем пациентам, подверженным явлениям гиперкоагуляции (церебральный тромбоз, некроз кожи, связанный с приемом кумарина и др.), даже если АЧТВ у них не удлинено.

При назначении определения ВА необходимо отменить больному прием гепарина за 2 дня и отменить кумариновые препараты за 2 недели до взятия крови, так как присутствие этих препаратов в крови может давать ложноположительные результаты.

При оценке полученных результатов необходимо ориентироваться на следующие данные: если результат составляет 1,2–1,5 усл. ед., то ВА содержится в малых количествах, и его активность небольшая; если 1,5–2,0 усл. ед., то ВА обнаруживается в умеренном количестве, и вероятность развития тромбоза значительно возрастает; если более 2,0 усл. ед., то ВА имеется в большом количестве, и вероятность возникновения тромбоза у больного очень велика.

Наличие в крови антител к фосфолипидам является одной из причин получения ложноположительных результатов исследований на сифилис в микрореакции преципитации с кардиолипиновым антигеном (VDRL-тест – Venereal Disease Research Laboratory). Посредством VDRL-теста определяют агглютинацию (склеивание) липидных частиц, которые содержат холестерин и кардиолипин, отрицательно заряженный фосфолипид. Антитела к фосфолипидам присоединяются к кардиолипину этих частиц и вызывают их агглютинацию. Аналогичная реакция наблюдается у больных сифилисом, у которых ложноположительный характер VDRL-теста должен быть доказан отрицательными результатами специфических методов исследования на сифилис, которые выявляют непосредственно антитела к трепонемным антигенами. Соотношение различных типов антител к фосфолипидам, выявляемых с помощью антикардиолипинового теста, теста на волчаночный антикоагулянт и ложноположительного VDRL-теста, представлено на рис. 1 [1].

Антитела к b-2-гликопротеину 1. b-2-гликопротеин 1 (аполипопротеин Н) является кофактором, который необходим, чтобы в крови произошло взаимодействие антифосфолипидных антител с фосфолипидами. Установлено, что присутствие в крови именно b-2-гликопротеин 1 зависимых антител к кардиолипину ассоциируется с развитием АФС, в то время как при инфекционных заболеваниях образуются b-2-гликопротеин 1 независимые антителак кардиолипину, наличие которых очень редко приводит к тромботическим нарушениям, характерным для АФС [16].

В исследованиях Т.М. Решетняк и соавт. [4] показано, что у больных СКВ повышение уровня антител к b-2-гликопротеину 1 относящихся к IgG в сыворотке крови коррелирует с развитием АФС в целом и его основными клиническими проявлениями в отдельности (венозный и артериальный тромбоз, акушерская патология и тромбоцитопения), а также некоторыми дополнительными признаками синдрома (трофические язвы голени, гемолитическая анемия и поражение клапанов сердца). Кроме того, увеличение уровня антител к b-2-гликопротеину 1 относящихся к IgМ ассоциируется с привычным невынашиванием беременности. Оба класса антител существенно чаще обнаруживаются у больных СКВ, имеющих в сыворотке крови повышенный уровень ВА и антител к кардиолипину. У больных СКВ антитела к b-2-гликопротеину 1 класса IgG, IgМ и IgА выявляют в 23 %, 20 % и 25 % случаев заболевания, при сочетании СКВ с тромбозом и/или тромбоцитопенией в 58 %, 42 % и 67 % случаев соответственно.

Исследование антител к b-2-гликопротеину 1 имеет одинаковую с антителами к кардиолипину чувствительность в отношении диагностики АФС (57 %), но более высокую специфичность (82 % и 43 % соответственно) [19]. При использовании в качестве «cutoff” для всех 3 типов антител (IgA, IgM, IgG) значений 20 МЕ/мл специфичность составляет для антител IgG – 100 %, IgA – 96 %, IgM – 93 % [10]. Положительная предсказательная ценность этого теста (т.е. вероятность того, что у больного с повышенным уровнем антител к b-2-гликопротеину 1 в сыворотке крови возникнут тромботические осложнения) составляет 29 %, а чувствительность (т.е. вероятность того, что у больного с тромбозами будут обнаружены антитела к b-2-гликопротеину 1) – 24 % [21]. Определение антител к b-2-гликопротеину 1 в сыворотке крови в настоящее время не входит в перечень официальных критериев диагностики АФС.

Антитела к протромбину. являются патогенными и напрямую ингибируют факторы коагуляции, что приводит к удлинению времени фосфолипидзависимых коагуляционных тестов.

Протромбин( фактор II) – витамин К-зависимый гликопротеин с мол. м. 72 кД, синтезируемый в печени и участвующий в свертывании крови. Протромбин обеспечивает создание на мембране поврежденных клеток комплекса факторов Va, Xa, и фосфолипидов. В результате чего в присутствии ионов Са²⁺ образуется протромбиназный комплекс, который осуществляет расщепление протомбина до тромбина, что в дальнейшем приводит к превращению фибриногена в фибрин.

Антитела к протромбину ответственные за эффект волчаночного антикоагулянта, обнаруживаются и у пациентов без СКВ, страдающих АФС. Предполагают, что связывание протромбина с фосфолипидами клеточных мембран увеличивается в присутствии антител к протромбину, в результате чего другие факторы коагуляции не могут связаться с фосфолипидами; возможно этим и объясняется удлинение времени фосфолипидзависимых коагуляционных тестов. Имеется и другая точка зрения, согласно которой протромбин при наличии антител перекрестно реагирует с плазминогеном, вследствие чего фибриноген не может быть расщеплен в фибрин. В связи с этим можно полагать, что существует 2 различных вида антител к протромбину, которые могут усиливать или ингибировать свертывание крови [23].

Специфичность определения антител класса IgM к протромбину в здоровой популяции составляет 97 %, IgG – 95 %. Антитела класса IgM к протромбину обнаруживают у 12,2 %, IgG – у 14,6 % больных СКВ. У пациентов с первичным АФС повышенный уровень антител класса IgM к протромбину выявляют в 27,3 %, IgG – в 18,2 % случаев заболевания [7].

Повышенный уровень антител к протромбину особенно у пациентов с СКВ и АФС увеличивает риск развития тромбоза глубоких вен. Кроме того, наличие антител к протромбину ассоциируется с тромбоэмболией легочной артерии и преждевременным прерыванием беременности. Они также предсказывают высокий риск развития инфаркта миокарда у пациентов с ИБС [23].Чувствительность определения антител IgG к протромбину для диагностики первичного АФС при преждевременном прерывании беременности составляет 74–80 %, а при вторичном АФС – 80–84 % [12].

Семейство белков аннексинов было открыто в 1990 году и сразу стало объектом интенсивного научного изучения и клинических исследований. В настоящее время в клетках млекопитающих описано 10 различных аннексинов. Аннексин V (анхорин СII, плацентарный антикоагулянтный протеин I, кальфобиндин I, кальций-зависимый фосфолипидсвязывающий протеин 33, плацентарный протеин 4) – кальций-зависимый протеин с мол. м. 35 кД, который представлен во многих тканях, а главным образом на эндотелиальных клетках и плаценте. В низких концентрациях аннексин V присутствует в тромбоцитах, в более высоких – в эритроцитах и лейкоцитах. Он обладает выраженными антикоагулятными свойствами in vitro. Это свойство аннекси-на V обусловлено его высоким сродством к анионным фосфолипидам и способностью препятствовать активированным факторам свертывания крови связываться с фосфолипидами клеточных мембран по кальций-зависимому механизму. Антикоагулянтный эффект аннексина V базируется на его способности образовывать двумерные кластеры на поверхности клеток. Эти кластеры являются высокоэффективным «щитом» против связывания факторов свертывающей системы крови. Аннексин V в обязательном порядке снитезируется трофобластами и локализуется на апикальных поверхностях микроворсинок. Удаление аннексина V с клеточной поверхности ускоряет коагуляцию плазмы крови. Эндотелиальные клетки сосудов также синтезируют значительное количество аннексина V. Обработка этих клеток хелатором или поликлональными антителами к аннексину V приводит к уско-рению коагуляции плазмы [6].

Плазменная мембрана клетки характеризуется ассимитричной структурой и исчезновение этой структуры служит первым признаком апоптоза. При нормальных условиях фосфатидилсерин локализуется на цитоплазматической стороне клеточной мембраны, в то время как при апоптозе он находится на наружной поверхности мембраны, где высокоспецифично связывается с аннексином V. Аннексин V ингибирует прокоагулянтную и провоспалительную активность умирающих клеток при апоптозе [18]. Уровень антител IgG и IgM к аннексину V в плазме в норме менее 0,12 усл. ед.; 0,12–0,24 – пограничные значения; выше 0,24 усл. ед. – положительный результат.

При оценке результатов тестов на наличие АФС врач-клиницист должен понимать, что течение многих инфекций (как вирусных, так и бактериальных) сопровождается транзиторным повышением уровня антител к фосфолипидам. Хронические инфекционные заболевания (наиболее часто ВИЧ), также провоцируют увеличение уровня антител к фосфолипидам. Целый ряд препаратов, включая фенотиазин, гидралазин, фенитоин, прокаинамид, хинидин и др. могут вызвать повышение концентрации антител к фосфолипидам в крови.

В заключение необходимо заметить, что некоторые типы антител к фосфолипидам выявляются у пациентов с АФС несколькими тестами, однако многие – только одним. Этим и обусловлен поиск и внедрение в клиническую практику новых тестов диагностики АФС. Кроме того, применение для постановки диагноза АФС только 2 официальных критериев (антитела к кардиолипину и ВА) вызывает неудовлетворенность многих клиницистов (оба теста могут быть отрицательными при наличии клинических проявлений АФС) и заставляет их активно использовать другие тесты.

Список литературы

2.        Калашникова Л.А., Насонов Е.Л., Александрова Е.Н. и др. Антитела к фосфолипидам и ишемические нарушения мозгового кровообращения в молодом возрасте // Журн. Неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. – 1997. – Т. 97. - № 6. – С. 59-65.

4.        Решетняк Т.М., Дексен Р.В., Алекберова З.С. и др. Антитела к b-2-гликопротеину 1 при системной красной волчанке: новый лабораторный маркер антифосфолипидного синдрома // Клиническая медицина. – 1998. – № 3. – С. 36-41.

5.        Alarcon-Segovia D. Deleze M., Oria C.V. et al. Antiphospholipid antibodies and the antiphospholipid syndrome in systemic lupus erythematosus. A perspective analysis of 500 consecutive patients // Medicine. – 1987. Vol. 68. – P. 353-365.

6.        Arnoux D., Boutiere B., Sanmarco M. Antiphospholipid antibodies: clinical significance and biological diagnosis // Ann. Biol. Clin. (Paris). – 2000. – Vol. 58. – N 5. – P. 557-574.

7.        Bertolaccini M.L., Atsumi T., Khamashta M.A. et al. Autoantibodies to human prothrombin and clinical manifestations in 207 patients with systemic lupus erythematosus // J. Rheumatol. – 1998. – Vol. 25. – N 6. – P. 1104-1108.

8.        Bogousslavsky J. Frontal stroke syndromes // Eur. Neurol. – 1994. Vol. 34. – N 6. P. 306-315.

9.        Brandt J.T., Triplett D.A., Rock W.A. et al. Effect of lupus anticoagulant on the activated partial thromboplastin time. Results of the College of American Pathologists survey program // Arch. Pathol. Lab. Med. – 1991. – Vol. 115. – N 2. – P. 109-114.

10.     Dier K., Fink C., Lopez L.R. Antiphospholipid syndrome: Detrmination of antibodies to beta 2 glycoprotein I (anti-b2GPI) by ELISA // Am. Clin. Lab. – 1998. – Vol. 17. – N 8. – P. 20-21.

11.     Ferro D., Quintarelli C., Rasura M. et al. Lupus anticoagulant and fibrinolytic system in young patients with stroke // Stroke. – 1993. – Vol. 24. – N 3. – P. 368-370.

12.     Geis W., Branch D.W. Obstetric implications of antiphospholipid antibodies: pregancy loss and other complications // Clin. Obstet. Gynecol. – 2001. Vol. 44. – N 1. – P. 2-10.

13.     Greaves M. Antiphospholipid syndrome: state of the art with emphasis on laboratory evaluation // Haemostasis. – 2000. – Vol. 30 (Suppl. 2). – P. 16-25.

14.     Gris J.C., Quere I., Sanmarco M. et al. Antiphospholipid and antiprotein Syndromes in non-trombotic, non autoimmune women with unexplained recurrent primary early foetal loss // Thromb. Haemost. – 2000. – Vol. – 84. – P. 228-236.

15.     Kaburaki J., Kuwana M., Yamamoto M et al. Clinical significance of antiannexin V antibodies in patients with systemic lupus erythematosus // Am. J. Hematol. – 1997. – Vol. 534. – N 3. – P. 209-213.

16.     Matsuura E., Igarashi Y., Yasuda T. et al. Heterogenety anticardiolipin antibodies defined by the anticardiolipin cofactor // J. Immunol. – 1992. – Vol. 148. – P. 3885-3891.

17.     Love P.E., Santoro S.A. Antiphospholipid antibodies: Anticardiolipin and the lupus anticoagulant in systemic lupus erythematosus (SLE) and in non-SLE disorders.// Ann. Intern. Med. – 1990. – Vol.112. – P.682-698.

18.     Reutelingsperger C.P.M., van Heerde W.L. Annexin V, the regulator of phosphatidylserine-catalyzed inflammation and coagulation during apoptosis // Cell Mol. Lafe Sci. – 1997. – Vol. 53. P. 527-532.

19.     Roubey R.A.S., Maldonado M.A., Byrd S.N. Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies to beta2-glycoprotein and conventional anticardiolipin immunoassay // Ibid. – 1996. – P. 1606-1607.

20.     Silveria L.H., Lopez L.R., Uzzle R.T. et al. IgA, IgG and IgM anticardiolipin antibodies in black patients with systemic lupus erythematosus // Arthr. Rheum 56^th Annual Meeting. – 1992. – P. 125.

22.     Vaarala O., Puurunen M., Manttari M. et al. Antibodies to protrombin imply a risk of myocardial infarction in middle-aged men // Thromb. Haemost. – 1996. – Vol. 75. – N 3. – P. 456-459.