Молекулярно-генетические и молекулярно-цитогенетические подходы для ускоренного создания селекционного материала растений с заданными свойствами

Москва 2010

Работа выполнена в Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К.А.Тимирязева

Научный консультант:

Доктор биологических наук, профессор Л.И.Хрусталева
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук А.В.Поляков

Доктор биологических наук А.А.Поморцев

Доктор сельскохозяйственных наук Н.И.Тимин

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Автореферат разослан « » 2010 г.

и размещен на сайте http://www.vak.edu.gov.ru

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Л.С.Большакова
Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Важной и актуальной проблемой в селекции растений является задача создания селекционного материала с заданными свойствами. Создание такого материала до сих пор остается сложной и, в отдельных случаях, трудновыполнимой задачей. С одной стороны, с появлением технологий генной инженерии стало возможным создание таких растений. Однако, несовершенство этих технологий и возможность генетической модификации только единичных признаков не всегда позволяет применять их на практике. С другой стороны классическими методами селекции создано огромное количество ценного селекционного материала. Применение и интеграция новых технологий молекулярно-генетической оценки этого материала в селекционный процесс позволит значительно сократить время создания генотипов с заданными свойствами.

За последние два десятилетия использование молекулярно-генетических методов позволило исследовать физическую и функциональную организацию геномов многих сельскохозяйственных культур (Collard and Mackil, 2007). Одним из основных понятий, объединяющих эти методы, является понятие «молекулярно-генетический маркер». Внедрение ДНК-маркеров позволяет значительно сократить затраты труда, ускорить и удешевить селекционный процесс, а также контролировать перенос хозяйственно-ценных генов от одного организма другому (Francia at al. 2005). В настоящее время разработано большое количество типов молекулярно-генетических маркеров, которые основаны на различных классах последовательностей геномной ДНК. Они позволяют выявлять генетическое разнообразие на молекулярном уровне организации ДНК, что является базисом, на котором основаны все дальнейшие теоретические (филогения, изучение организации генома) и прикладные (картирование, маркирование генов, генотипирование) исследования.

При отборе нужных генотипов в расщепляющихся популяциях, селекционер сталкивается обычно со следующими проблемами:

1) Для отбора генотипа по заданному признаку необходима большая расщепляющаяся популяция;

2) Необходимо дождаться нужного поколения (F₅, F₆);

3) Становится достаточно сложно проводить отбор в популяции по нужному признаку, если его проявление зависит от условий окружающей среды;

4) Чаще всего приходится ждать до поздних этапов онтогенеза растений, чтобы провести отбор по признаку;

5) Трудно проводить накопление генов, например устойчивости, так как сложно провести отбор генов в присутствии уже существующих (Gupta and Varshney, 2000).

Помочь решить данные проблемы может использование близко сцепленных с признаком молекулярных маркеров, полученных различными методами.

До недавнего времени в селекции сельскохозяйственных культур использовались только морфологические маркеры. Они могли проявляться на различных этапах развития растений, идентифицироваться визуально или в результате биохимических исследований. При этом проявление тех или иных признаков в значительно степени зависит от условий внешней среды. Традиционные методы селекции на устойчивость требуют создания инфекционных фонов и трудоемкую оценку каждого образца. Проведение таких работ связано со значительными затратами труда и времени. Селекционный процесс для однолетних культур затягивается до 10, а для двулетних до 20 лет.

Использование ДНК-маркеров позволяет значительно сократить затраты труда, ускорить и удешевить селекционный процесс, а также контролировать перенос хозяйственно-ценных генов от одного организма другому. Наиболее эффективными молекулярными маркерами являются те, которые основаны на характерных особенностях нуклеотидных последовательностей самих генов. Для разработки таких ДНК-маркеров необходимо выявить различия в структуре последовательностей ДНК локусов (генов) у форм растений отличающихся по проявлению признака, например по устойчивости к фитопатогену.

Цель и задачи исследования. Цель исследований – разработка комплексной системы анализа геномов растений, основанной на использовании современных молекулярно-генетических и молекулярно-цитогенетических технологий для эффективной и ускоренной селекции растений

Задачи исследования

1. 
   Разработать систему идентификации родительских геномов и мониторинга чужеродного генетического материала в селекционных программах с использованием межвидовой гибридизации.
   
2. 
   Изучить особенности организации геномов растений, представителей различных семейств, для разработки эффективных ДНК-маркеров.
   
3. 
   Разработать методологию использования молекулярных и молекулярно-цитогенетических маркеров на различных этапах селекционного процесса.
   
4. 
   Разработать новые подходы изучения механизмов формирования 2n-гамет с целью преодоления межвидовой несовместимости при создании ценного селекционного материала.
   
5. 
   Исследовать возможности использования ISSR-PCR-маркеров для оценки исходного селекционного материала и при создании эффективных ДНК-маркеров.
   
6. 
   Клонировать и охарактеризовать последовательности генов устойчивости растений и их аналогов.
   
7. 
   Создать ДНК-маркеры на хозяйственно-ценные гены томата, риса, огурца, малины и хмеля.
   

Разработана оптимизированная методика совместного применения дифференциального окрашивания хромосом, геномной гибридизации in situ и ДНК-маркирования, позволяющая проводить эффективное выявление межгеномных транслокаций у тритикале и пшеницы.

Впервые продемонстрирована возможность использования высокоповторяющейся геномспецифичной последовательности ДНК GenBR-1 для визуализации генома B капустных в разном геномном окружении.

С помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) впервые установлена геномная организация высокоповторяющихся последовательностей ДНК Ty-1-copia-подобных ретротранспозонов томата. Показано, что у томата ретротранспозоны локализованы в прицентромерных гетерохроматиновых регионах хромосом. Подтверждена эффективность использования пахитенных хромосом томата для такого анализа. Для растений с крупными геномами (лилии, крокусы, тюльпаны и лук) показано равномерное распределение Ty-1-copia-подобных ретротранспозонов, за исключением C-бэндинг положительных регионов хромосом, где они не выявляются.

Впервые клонирована высокоповторяющаяся субтеломерная последовательность ДНК хмеля. С помощью FISH анализа показана субтеломерная локализация этой последовательности на хромосомах. Выявлено, что эта последовательность может служить цитогенетическим маркером для идентификации хромосом хмеля. Впервые установлено, что последовательности генов рибосомной РНК (45S и 5S) являются эффективными цитогенетическими маркерами для идентификации трех из 10 хромосом хмеля с использованием флуоресцентной гибридизации in situ.

Выявлен высокий полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК (ISSR) на видовом и межвидовом уровнях у видов Solanum, Humulus lupulus, Cucumber и Rubus. Рекомендован набор ISSR праймеров для анализа исходных родительских и гибридных форм при внутри- и межвидовой гибридизации, а также форм растений томата с различным уровнем интрогрессии генетического материала. На основе выявленного полиморфизма ISSR создана интегрированная генетическая карта межмикросателлитных последовательностей ДНК томата и высокоэффективные ДНК-маркеры для выявления пола у растений хмеля и признака ремонтантности малины.

Впервые проведено клонирование двух последовательностей ДНК, специфичных для хромосомы Y мужских растений хмеля. На основе анализа клонированных последовательностей созданы эффективные ДНК маркеры для выявления пола растений хмеля, которые могут использоваться в селекционном процессе.

Впервые клонированы фрагменты последовательностей генов устойчивости подсолнечника остролистного. Установлена их высокая степень гомологии с ранее клонированными генами устойчивости растений.

Идентифицированы молекулярные маркеры WA-типа ЦМС риса. Идентифицированы и картированы молекулярные маркеры, тесно сцепленные с геном восстановления фертильности Rf4, расположенные на длинном плече 10-й хромосомы риса.

Продемонстрирована высокая эффективность сравнительного анализа ДНК локусов генов устойчивости у устойчивых и неустойчивых генотипов растений для создания надежных ДНК-маркеров. Созданы кодоминантные CAPS-маркеры генов устойчивости к фузариозу (I2) и ветрициллезу (Ve) томата. Созданы ДНК диагностикумы на гены устойчивости томата - к фузариозу и вертициллезу, хмеля – на определение пола растений, риса – на ЦМС и ген восстановления фертильности, и оптимизированы условия применения ДНК маркеров на гены устойчивости томата к нематоде, ВТМ, кладоспориозу. Предложены оптимальные высокопроизводительные методики выделения ДНК для массового скрининга селекционного материала. Разработаны методы и схемы высокопроизводительной оценки на наличие хозяйственно-ценных признаков в исходном селекционном материале с помощью ДНК технологий. Получены перспективные формы томата, сочетающие несколько генов устойчивости к болезням и вредителям в одном генотипе, и создан коммерческий гибрид F₁.

1.Методология использования молекулярно-генетических и молекулярно-цитогенетических методов в селекции основанная на:

• 
  достижениях в геномике и биоинформатике;
  
• 
  надежности и эффективности молекулярно-генетических и молекулярно-цитогенетических ДНК-маркеров;
  
• 
  возможности ускорения селекционного процесса в два раза и сокращения расходов при создании гибридов F₁ овощных культур;
  
• 
  предлагаемой схеме интеграции ДНК технологий для сопровождения селекционного процесса.
  

3. Эффективные ДНК-маркеры для селекции растений по хозяйственно-ценным признакам.

Исследования выполнены в 1996-2009 годах в Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К.А.Тимирязева.

В работе использовали 6 форм межвидовых гибридов лилий (PRI, Wageningen), семена первичных тритикале АД-1, АД-3, АД-4, межамфиплоидного гибрида (МАГ) и перспективных линий тритикале 491-07 и 497-07 (ГНУ НИИСХ Юго-Востока), селекционные формы тритикале, сорта и линии яровой и озимой пшеницы, коллекцию видов томата и их межвидовые гибриды и моносомно-дополненные формы (кафедра генетики РГАУ-МСХА), расщепляющиеся по хозяйственно-ценным признакам селекционные популяции томата (Селекционная станция имени Н.Н.Тимофеева, агрофирмы «Ильинична», «Гавриш», «Манул»), набор видов Brassicaceae с геномом В (коллекция ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии), коллекцию из более 60 форм и сортов хмеля (ВНИПТИХ, Цивильск, Центр молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА, Университет г.Штутгарта, Германия), ЦМС линии капусты пекинской Brassica pekinensis (Селекционная станция имени Н.Н.Тимофеева), селекционные линии риса с WA-типом ЦМС и генами восстановления фертильности (Иран) (4 ЦМС линии: Neda-A, IR67017-180-2-1-2-А, Usen-A, IR68897-A, 4 их соответствующих фертильных аналогов (линий закрепителей) Neda-B, IR67017-180-2-1-2-B, Usen-B, IR68897-B; 7 фертильных линий восстановителей: IR24, IR28, Amol2, IR36 IR62030, IR60966, Amol1; 7 Популяций F2), аллоцитоплазматические линии пшеницы (РУДН), 64 образца ДНК, выделенные из растений F₂ расщепляющейся популяции межвидового гибрида S. lycopersicum Х S. pennellii (образцы ДНК подготовлены и предоставлены док. A. W. van Heusden, PRI, Wageningen, The Netherlands).

Цитологические препараты готовили по стандартным методикам приготовления постоянных препаратов методами раздавливания и распластывания митотических и мейотических хромосом (Пухальский и др., 2004; Zhong X.-B. et al., 1996).

Геномную in situ гибридизацию осуществляли по стандартной методике (Schwarzacher., 1992), с некоторыми модификациями. Хромосомы контрокрашивали пропидий-йодидом или DAPI 1 мг/мл. Анализ результатов проводили на флуоресцентных микроскопах “Axiophot” и “AxioImager” (“Zeiss”, Германия) с соответствующими системами фильтров. Для анализа изображений производили фотосъемку на пленку Fuji 400 или использовали цифровую фотокамеру с соответствующим программным обеспечением. После проявки пленку сканировали в компьютер и обрабатывали изображение, используя программу Photoshop CS.

Выделение ДНК осуществляли из молодых листьев или семядолей вегетирующих растений, а также этиолированных проростков пшеницы, ржи и тритикале по стандартным методикам с некоторыми модификациями (Bernatzky and Tanksley, 1986; Van der Beek et al., 1991; Fulton et al., 1995).

Праймеры для амплификации и флуоресцентные ДНК-зонды синтезированы в ЗАО «Синтол», Москва. Амплификацию проводили на амплификаторах «Терцик» («ДНК-технология», Москва) и «DNA Engine Tetrad 2» (Bio-Rad, USA). Детекцию флуоресценции осуществляли на приборе «Джин» с программным обеспечением фирмы изготовителя («ДНК-технология», Москва). Условия проведения амплификации были индивидуальны для каждого из праймеров. В некоторых случаях производили оптимизацию условий амплификации.

Продукты ПЦР разделяли в 1,5-2% агарозном геле с буфером ТВЕ при напряженности поля 6 V/см. В качестве маркера молекулярного размера использовали «100 bp leader» (Fermentas).

Клонирование ПЦР-продуктов проводили с помощью набора pGEM®-T Easy Vector Systems (Promega, USA) в соответствии с инструкцией, предложенной производителем.

Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программных пакетов GeneDoc (Multiple sequence alignment editor and shading utility. Ver. 2.6.002. Copyright^© by K. Nicholas), Clone manager 6 version 6.00 (Sci Ed Central). Поиск гомологичных последовательностей и их анализ проводили в открытых базах генетических данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), Sol Genomic Network (http://www.sgn.cornell.edu/about/tomato_project), EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk).

Филогенетическая модель родства исследованных видов была построена путем обработки данных ISSR-PCR-анализ с помощью кластерного анализа по методу невзвешенного попарного арифметического среднего UPGMA (Nei et al., 1983). В качестве филогенетической дистанции между двумя видами брали отношение полученных при сравнении количества полиморфных ISSR-фрагментов к общему количеству ISSR-фрагментов.

Обработку данных по расщеплению и расчет генетических расстояний проводили с помощью программного пакета MapMaker/EXP 3.0 (Lincoln et al. 1992). Для анализа сцепления по отдельным маркерам, частота рекомбинации между маркером и локусом была рассчитана с использованием метода максимального правдоподобия (Allard, 1956).

Успешная межвидовая гибридизация является базой для интрогрессии хозяйственно-ценных признаков в культурные растения. В зависимости от объекта, целей и задач, стоящих в процессе интрогрессии генетического материала, требуется разработка различных систем мониторинга чужеродного генетического материала. Они могут быть основаны на молекулярно-цитогенетических и молекулярно-генетических методах, как в отдельности, так и их комлексе.

Рис 1 . Геномная гибридизация in situ на межвидовых гибридах лилий. a. F₁:(L.longiflorum х азиатский гибрид (синие хромосомы) (LA) b. F₁ (азиатский гибрид х [L.longif1orum х азиатский гибрид (ALA)] c. F₁ восточный гибрид (красные хромосомы) х (L. longiflorum х азиатский гибрид). Стрелками указаны сайты рекомбинации. L.longiflorum - зеленые хромосомы, азиатский гибрид - синие хромосомы, восточный гибрид - красные хромосомы).

В растении ALA-2 (2n=36) выявлено три рекомбинантных хромосомы, 10 принадлежащих L.longifloruт и 23 азиатскому гибриду. Две ре­комбинантные хромосомы имели по два сайта кроссинговера и одна - ­один сайт. Три и шесть сайтов рДНК, принадлежащих L. longifloruт и азиатскому гибриду соответственно, было обнаружено в этом расте­нии. Растение ALA-3 (2n=36) имело 12 хромосом от L. longif1oruт и 24 хромосомы азиатского гибрида. В растении ALA-4 было обнаружено 48 хромосом, из них 12 имеют свое происхождение от L. longif1oruт.

Гибрид F₁: Восточный гибрид х (L. longiflorum х азиатский гибрид) (OLA). Для визуали­зации и анализа геномной организации трехвидового гибрида мы ус­пешно использовали метод многоцветной геномной in situ гибридиза­ции. В растении OLA (2n=36) все три родительских генома были четко различимы (рис 1c). Анализ кариотипа показал, что данный гибрид содержит по 12 гомеологичных нерекомбинантных хромо­сом каждого родителя L.longiflorum, восточный гибрид и азиатский гибрид.

Итак, адаптированный нами применительно к лилиям метод геномной in situ гибридизации позволил четко различить геномы L.longiflorum, восточных и азиатских лилий в гибридах, полученных при их скрещиваниях. Исходя из этого, мы можем заключить, что L.longiflorum, восточная и азиатская лилии содержат в своих геномах различающиеся семейства высоко- и среднеповторяющейся ДНК. Изменчивость этих типов ДНК счита­ется источником дифференциации видов (Dеаn and Schmidt, 1995). Та­кая дифференциация и позволяет визуализовать геномы в межвидовых гибридах с использованием геномной in situ гибридизации (Schwarzacher et аl. 1992).

Мониторинг чужеродного хроматина при интрогрессии генети­ческого материала от одного вида к другому является очень важ­ным. На данный момент геномная in situ гибридизация - наиболее эффективный метод для такого мониторинга и позволяет четко уста­новить геномный состав межвидовых гибридов. Нами этот метод успешно применен на межвидовых гибридах ли­лий. При этом нам удалось визуализовать сайты рекомбинации и таким образом показать возможность интрогрессии генетического материала. Основным преимуществом метода геномной гиб­ридизации in situ является и то, что интрогрессию в гибридах лилий из-за слабой изученности их геномов, невоз­можно установить с использованием других молекулярных методов (RFLP, RAPD, AFLP и др.).

Успех интрогрессии полностью зависит от гомеологической реком­бинации между родительскими геномами в мейозе F₁ гибридов и от их фертильности (van Tuyl and DeJeu, 1997). Растения F₁ L. longiflorum х азиатский гибрид обычно полностью стерильны. Для преодоления этой проблемы на лилиях в настоящее время используются два подхода: ми­тотическое удвоение хромосом и применение растений, формирующих нередуцированные 2n-гаметы (van Tuyl et аl, 1989). Последний подход наиболее предпочтителен для селекционных программ, в которых упор делается на использование интрогрессии генетического материала от одного вида к другому. Формирование нередуцированных гамет связано обычно с двумя типами нарушения мейоза: 1. отсутствием первого мейотического деления (first division restitution - FDR); 2. отсутствием второго мейотического деления (second division restitution - SDR) (Mok and Peloquin, 1975; МсСоу, 1982; Hermsen, 1984). Для использования гибридных растений, формирующих 2n-гаметы в селекционных про­граммах, необходимо знать путь формирования таких гамет (FDR или SDR). В нередуцированных гаметах, образующихся в результате FDR, в каждую гамету попадают несестринские хроматиды каждой гомоло­гичной хромосомы, в то время как в результате SDR сестринские хро­матиды попадают в одну гамету (Ramana, 1979). В случае межвидовых гибридов по одной хроматиде от каждого родителя попадает в гаметы, сформированные в результате FDR. Отсутствие гомологичных хромо­сом L.longiflorum в ALA и OLA гибридах указывает на механизм FDR формирования 2n-гамет в LА-гибридах, которые были использованы в качестве отцовской формы

При анализе геномов гибридных растений ALA-I и ALA-2 нами про­демонстрировано наличие рекомбинации между геномами L.longiflorum и азиатских гибридов. Эти данные указывают на форми­рование хиазм в процессе формирования 2n-гамет. Отсутствие реком­бинантных хромосом в растениях АLА-3, ALA-4 и OLA, вероятно, свя­зано с полным подавлением или низким уровнем спаривания между гомеологичными хромосомами.

Использование наряду с геномной пробой рибосомальной ДНК рТа 71 позволило получить дополнительную информацию и идентифициро­вать хромосомы, несущие ядрышкообразующие регионы. Проанализировав распределение рДНК в ALA-1 растении, мы также получили дополнительное подтверждение образования 2n-гамет через FDR механизм.

Таким образом, использование геномной гибридизации in situ по­зволило получить нам ценную информацию о частоте рекомбинации между геномами L. longiflorum и азиатского гибрида в образующих 2n­ гаметы F₁-гибридах. Результаты нашей работы указывают на то, что такие F₁-гибриды могут быть использованы для интрогрессии генети­ческого материала от одного вида к другому.

1.1.2. Геномная гибридизация in situ на моносомно дополненных линиях томата. Геномная гибридизация in situ продемонстрировала свою эффективность и в случае анализа дополненных линий томата по второй хромосоме S. lycopersicoides. При этом мониторинг чужеродного хроматина в геноме томата возможно было проводить, как на митотических, так и мейотических хромосомах.
1.2. Совместное использование молекулярно-цитогенетических и молекулярно-генетических методов.

1.2.1. Тритикале. Тритикале - это относительно новая и перспективная культура, получившая признание производителей сельскохозяйственной продукции в последние десятилетия. В производстве представлены в основном гексаплоидные тритикале. Причем, как демонстрируют исследования, перспективные линии и сорта тритикале часто несут замещения или транслокации (Zillinsky, 1980; Gustafson, Lukaszewsky, 1984; Соловьев, 2007). Замещения и транслокации хромосом позволяют решать проблемы, характерные для яровой тритикале, как это показано в отношении признаков хлебопекарных качеств зерна, устойчивости к прорастанию на корню, толерантности к ионам алюминия и другие (Rybka, 2003; Oracka and Łapiński, 2006; Wos et al., 2006). Таким образом, идентификация и подробная молекулярно-генетическая характеристика таких линий является важной проблемой. Эта информация будет основой для создания новых перспективных линий тритикале с заданными свойствами.

Идентификация хромосом и их участков может быть выполнена с использованием различных методов – дифференциального окрашивания, молекулярного маркирования, геномной гибридизации in situ. Применение комплексного подхода с использованием разных методов позволяет осуществлять надежную идентификацию хромосомных наборов тритикале.

С целью разработки такого подхода в нашей работе использовалась модельная линия тритикале 131/7, несущая пшенично-ржаную транслокацию. Для идентификации хромосом, вовлеченных в эту транслокацию, применяли в комплексе молекулярно-генетические и молекулярно-цитогенетические методы. На первом этапе была физически картирована точка транслокации с использованием адаптированного нами метода гeномной гибридизации in situ после дифференциального окрашивания на одной и той же метафазной пластинке (Рис.2).


Рис.2. Совмещение дифференциального окрашивания и гибридизации in situ на одной и той же метафазной пластинке хромосом линии тритикале 131/7 (генетический материал ржи имеет желтый цвет, пшеницы – красный).

После анализа рисунка дифференциального окрашивания хромосом нами определено, что в геноме линии 131/7 присутствует замещение 2В хромосомы на 2D-хромосому и транслокация длинного плеча хромосомы 2В в хромосому 2R.

Однако, применение только цитологических маркеров для характеристики хромосом не может полностью исключить ошибок при идентификации генетического материала (Devos et al., 2000, Pestsova et al., 2000; Salina et al., 2003). Для подтверждения данных молекулярно-цитогенетического анализа нами был использован метод молекулярного маркирования. Для этого экспериментальным путем были подобраны микросателлитные маркеры, специфичные для конкретных хромосом. Отсутствие амплификации таких маркеров на других геномах дало возможность нам использовать их как STS-маркеры. Это позволило удешевить проведение такого анализа, так как не требуется проведение дорогостоящего денатурирующего гель-электрофореза. К преимуществам такого подхода можно отнести и отсутствие необходимости выявления полиморфизма исходных форм, участвовавших в создании тритикале. Нами были подобраны следующие микросателлитные маркеры на длинное и короткое плечи 2В хромосомы: Xwmc317, Xwmc361, Xwmc332,Xgwm120, Xwmc441, Xbarc167, Xbarc1064, Xbarc1139, Xwmc592, Xwmc477, Xbarc13, Xgwm429 (рис. 3), а также маркеры, специфичные на короткое и длинное плечо всех хромосом генома D (Табл.1).

Таблица 1.

Результаты амплификации микросателлитных маркеров, специфичных для D-генома у линии тритикале 131/7.

Локали- Зация	SSR- маркер	Наличие ампли- фикации	Локал изация	SSR- маркер	Наличие ампли- фикации
1DL	Xbarc271	-	4DS	Xwmc285	-
1DS	Xbarc149	-	5DL	Xbarc110	-
2DL	Xgwm349	+	5DS	Xwmc233	-
2DS	Xwmc111	+	6DL	Xbarc1030	-
3DL	Xbarc270	-	6DS	Xbarc196	-
3DS	Xbarc6	-	7DL	Xbarc53	-
4DL	Xbarc1183	-	7DS	Xwmc506	-