Обозначения: 1, 2, 3, 4 и 5 соответственно изоферменты ЛДГ-1, ЛДГ-2, ЛДГ-3, ЛДГ-4 и ЛДГ-5. Стрелки Н и М указывают на изоферменты с преобладанием Н и М субъединиц

Обозначения: 1, 2, 3, 4 и 5 соответственно изоферменты ЛДГ-1, ЛДГ-2, ЛДГ-3, ЛДГ-4 и ЛДГ-5. Стрелки Н и М указывают на изоферменты с преобладанием Н и М субъединиц.

симпатических нейронах и сателлитных глиоцитах выявляется высокая актив-ность Н и М-изоформ ЛДГ (рис.4). Вместе с тем в указанных клетках обнару-живаются важные принципиальные различия в соотношении активности меж-ду Н и М изоформами ЛДГ (рис.4).

В нейронах, как и в симпатическом ганглии, в спектре ЛДГ преобладает активность Н-изоформ (Н/М > 1). Такая особенность изоферментного про-филя ЛДГ нейронов и ганглия в целом выглядит закономерной, так как вы-сокий уровень активности Н-изоформ необходим для реализации высоко-эффективной аэробной фазы энергопродукции (Хочачка П., Сомеро Дж., 1977; Gladden L., 2004).

Вместе с тем изоферментный профиль ЛДГ расположенных вокруг ней-ронов сателлитных глиоцитов характеризуется противоположной направ-ленностью (рис.4). В этих клетках наиболее активны М-изоформы (Н/М < 1), что свидетельствует, с учетом субстратной специфичности М-изоформ (Pellerin L., 2003; Bouzier-Sore A., et al., 2003), о том, что сателлитные глио-циты продуцируют лактат в значительно большем количестве, чем нейроны.

Выявленные на клеточном уровне различия ферментативных систем ЛДГ указывают, таким образом, на существование в симпатическом ганглии градиента в распределении лактата между симпатическими нейронами и окружающими их сателлитными глиоцитами. Наличие такого градиента между клетками, в соответствии с современными представлениями био-энергетики (Gladden L., 2004; Philp A. et al., 2005; Schurr A., 2006), создает принципиальные возможности для осуществления межклеточного транспорта лактата, который может использоваться в качестве дополнительного энер-гетического ресурса для интенсивно работающих клеток. Именно существо-вание такого механизма на основе трансферта лактата через глио-синап-тические контакты в активно работающие нейроны из астроцитов, которые имеют точно такую же, как и сателлитные глиоциты, анаэробную направ-ленность энергетического обмена, предусматривается в головном мозге в соответствии с концепцией лактатного челночного механизма ANLSH (astrocyte-neuron lactate shuttle hypothesis) (Pellerin L., 2003; Pellerin L., Magistretty P., 2004; Pierre K., Pellerin L., 2005).

Можно полагать в связи с вышеизложенным, что установленные разли-чия в ферментативных системах ЛДГ симпатических нейронов и сателлит-ных глиоцитов характеризуют те же клеточные механизмы энергетического взаимодействия, которые предусматриваются концепцией ANLSH, и сател-литные глиоциты симпатического ганглия наделены подобно астроцитам функциями энергообеспечения нейронов.

К

Рис. 3. Редукция изоферментного состава и активности ЛДГ в ганглии при уменьшении числа свободных никотиновых холинорецепторов.

В редуцированном таким образом спектре ЛДГ, состоящем только из трех изоферментов, заметно выражена поляризация между активностью анод-ных фракций ЛДГ-1 и ЛДГ-2, на долю которых приходится 86% всей ак-тивности ферментативной системы ЛДГ, и активностью гибридной изо-формы ЛДГ-3 (рис.3). На долю последней приходится только 14% всей ак-тивности ЛДГ, в связи, с чем она не вносит заметный вклад в общую актив-ность ЛДГ.

В результате таких изменений, в спектре ЛДГ при частичной блокаде нХР вклад (83%) Н-субъединиц в общую активность ЛДГ, по сравнению с нормой заметно возрастает (рис.3). Это означает, с учетом функциональной значимости Н и М изоформ (Pellerin L., 2003; Gladden L., 2004), что метабо-лическая направленность ферментативной системы ЛДГ и характер ее воз-действия на энергопродуцирующие механизмы в ганглии при блокировании рецепторов меняются: основной процесс наработки пирувата из лактата сох-раняется, тогда как катализация обратного процесса - превращения пирувата в лактат в значительной степени снижается.

Следует при этом подчеркнуть, что в силу резкого, почти пятикратного падения активности ЛДГ, в результате которого активность фермента состав-ляет только 19% от уровня контроля (рис.3), сама по себе степень участия ферментативной системы ЛДГ в реализации аэробной фазы энергопро-дукции при частичном блокировании нХР в целом оказывается существенно сниженной.

При полном блокировании нХР процесс сжатия спектра ЛДГ продол-жается (рис.3). Из спектра окончательно исчезает гибридная форма изофер-мента ЛДГ-3 и в составе ферментативной системы ЛДГ остаются только две изоформы: ЛДГ-1 и ЛДГ-2. Активность этих изоформ, по сравнению с условиями частичного блокирования рецепторов, при этом еще более снижается.

Следует подчеркнуть, что, и при частичном блокировании и при полном блокировании нХР, сохраняется полная синхронность в изменениях ЛДГ-1 и ЛДГ-2. В результате этого уровень остаточной активности одинаков для ЛДГ-1 и ЛДГ-2. Этот показатель (16%), равно как остаточная активность ЛДГ в целом (9%), существенно ниже (р  0,01), чем величина этих показа-телей при частичном блокировании никотиновых рецепторов.

В редуцированном таким образом спектре, полностью представленным только двумя изоферментами, суммарный вклад в ферментативную актив-ность Н-субъединиц составляет 89%, а М-субъединиц - всего 11%. Это гово-рит о том, что метаболическая направленность ферментативной системы ЛДГ и ее воздействие на энергопродуцирующие механизмы в ганглии при полной блокаде нХР приобретают практически односторонний характер, ориентиро-ванный на превращение лактата в пируват, на фоне практически полного прекращения обратной реакции с участием ЛДГ – превращения пирувата в лактат.

Редукция изоферментного состава и крайне низкий уровень активности ЛДГ при полном блокировании никотиновых холинорецепторов значительно ограничивает потенциальные возможности ферментативной системы ЛДГ для участия в энергопродуцирующих механизмах ганглия.

Таким образом, частичная блокада нХР в симпатическом ганглии вы-зывает редукцию спектра ЛДГ и значительное снижение активности всей ферментативной системы ЛДГ. Полная блокада нХР практически исключает участие этого фермента, как в энергообеспечении, так и в других процессах метаболизма. Вместе с этим блокирование холинорецепторов трансфор-мирует функциональную направленность ферментативной системы ЛДГ, существенно сдвигая катализируемую этой системой реакцию взаимо-превращения пирувата и лактата в сторону преимущественного образования пирувата.

Полученные результаты позволяют заключить, что органноспеци-фичный для КШСГ изоферментный состав и активность ЛДГ поддерживают-ся только при нормально функционирующих нейрональных никотиновых холинорецепторах и указывают на важную роль этих рецепторов в меха-низмах гомеостаза ферментативной системы ЛДГ.
Влияние блокирования никотиновых холинорецепторов на ферментативную систему ЛДГ в симпатических нейронах и сателлитных глиоцитах
В нейронах блокирование нХР вызывает значительное снижение актив-ности изоферментов ЛДГ (рис.4).

Рис.4. Ферментативная система ЛДГ в клетках симпатического ганглия в разных условиях блокады никотиновых холинорецепторов.

Также как и в целом ганглии, в нейронах, по мере сокращения числа свободно функционирующих нХР, наблюдается синхронное, весьма зна-чительное и последовательное падение активности ЛДГ и входящих в ее сос-тав изоформ (рис.4). При блокировании части рецепторов активность общей ЛДГ в нейронах уменьшается на 41,5%, при полном блокировании – умень-шение активности фермента составляет уже 71% относительно уровня его ферментативной активности в контроле. Такая же последовательность в ин-гибировании ферментативной активности при усилении блокирующего воз-действия регистрируется и в отношении отдельных изоферментов ЛДГ. Для Н-изоформ полученное снижение активности составляет соответственно 25% при частичной, и 58% при полной блокаде. Для М-изоформ уровень снижения активности относительно контрольных показателей составляет соответ-ственно 36% и 62%.

В динамике изменения активности всех трех составляющих фермента-тивной системы ЛДГ (общей ЛДГ, Н- и М-изоформ), которые определяются в рамках одного и того же гистохимического метода, но с помощью независя-щих друг от друга цитохимических реакций, прослеживается совпадающая тенденция, которая выражается в том, что вместе с уменьшением свободно функционирующих никотиновых холинорецепторов, линейно, с довольно высоким коэффициентом детерминированности (R² = 0,99) синхронно умень-шается и их активность (рис.4).

Важным следствием блокады является то, что в нейронах вместе с ингибированием активности ферментативной системы ЛДГ, происходит сдвиг в сторону большей активности Н-субъединиц, осуществляющих прев-ращение лактата в пируват. Связано это с тем, что активность М-изоформы при блокаде нХР снижается в большей степени, чем активность Н-изоформы, в результате чего величина отношения Н/М в нейронах при блокаде, хотя и незначительно, но повышается (рис.4) и при частичной блокаде отношение Н/М устанавливается на уровне более высоком, чем контрольный (p  0,05).

Вышеизложенные результаты показывают, что уменьшение уровня сво-бодных нХР вызывает сдвиги в функциональной направленности фермента-тивной системы ЛДГ в нейронах в сторону интенсификации участия фермен-та в процессах аэробной фазы энергопродукции.

Полученная при блокаде однотипность в изменениях ЛДГ, Н и М ее изоформ, совокупный вклад которых по существу определяет общий уровень активности ЛДГ, каждая из которых выявлялась с помощью разных цито-химических методик, объективно указывает на закономерное участие нХР в регуляции активности всей ферментативной системы ЛДГ нейронов. При этом характер цитохимических изменений ЛДГ в нейронах достаточно хорошо согласуется с аналогичными изменениями ЛДГ, полученными в тех же условиях с помощью биохимического анализа этого фермента на уровне целого симпатического ганглия.

Таким образом, нейрональным никотиновым холинорецепторам при-надлежит ключевая роль в регулировании ферментативной системы ЛДГ как на уровне симпатического ганглия, так и входящих в его состав нейронов.

Совокупность представленных результатов позволяет заключить, что синаптический сигнал через нХР представляется важной составной частью механизмов, которые, во-первых, формируют изоферментный спектр ЛДГ, во-вторых, обеспечивают необходимый уровень активности входящих в состав ЛДГ ферментов и, в-третьих, поддерживают ее функциональную специ-фичность, направленную на обеспечение необходимой для нормальной деятельности ганглия сбалансированности лактат-пируватной реакции.

В сателлитных глиоцитах расположенных вокруг нейронов наблю-дается при блокаде нХР другие изменения активности ЛДГ (рис.4).

В этих клетках наибольшие изменения происходят только с М изофор-мами ЛДГ, активность которых по мере усиления блокирующего воздействия значительно снижается - на 43% относительно контрольных показателей при частичной блокаде нХР и на 55,5% - при полной блокаде. Активность Н-форм ЛДГ в глиоцитах, в отличие от нейронов, при этом не меняется (р  0,05). Достоверное снижение активности общей ЛДГ (p  0,05) регистрируется только при полной блокаде нХР (рис.4) и очевидно связано с отмеченными выше изменениями в активности М изоформ.

Важным следствием особенной реакции ЛДГ сателлитных глиоцитов на блокаду нХР является резкое изменение в этих клетках отношения между уровнями активности изоформ ЛДГ (Н/М), которое претерпевает, по срав-нению с интактными клетками полную инверсию (рис.4). Так, при частичной блокаде отношение Н/М в указанных клетках уже выше единицы (1,15). При полной блокаде изоферментный профиль ЛДГ глиоцитов статистически значимо (р>0,05) не отличается от величины отношения Н/М, характеризу-ющего нейроны интактного ганглия. (рис.4).

Таким образом, при блокаде нХР в сателлитных глиоцитах происходит трансформация энергетических механизмов, по крайней мере, в отношении ферментативной системы ЛДГ, которая начинает функционировать также как в интактных симпатических нейронах.

Полученные экспериментальные результаты позволяет закономерно полагать, что в сателлитных глиоцитах механизмы энергетического обмена, по крайней мере, в части функционирования ферментативной системы ЛДГ, контролируются через никотиновые рецепторы холинергической синапти-ческой активностью симпатических нейронов, которые тем самым могут прямо влиять на процессы выработки лактата в окружающих симпатические нейроны сателлитных глиоцитах.

Установленная в работе интеграция энергетических процессов между нейронами и окружающих их сателлитными глиоцитами, которая детермини-руется нейронами через синаптическое взаимодействие с нХР, может рас-сматриваться как один из ключевых механизмов энергетической организации КШСГ, подобно аналогичному клеточному механизму энергетической орга-низации головного мозга в соответствии концепцией лактатного челночного механизма ANLSH (Pellerin L., 2003; Pellerin L., Magistretty P., 2004; Pierre K., Pellerin L., 2005).

Рис.5. Дефицит в содержании аденилатных макроэргов в симпатическом ганглии при блокировании никотиновых холинорецепторов (нХР)

Все различия достоверны (U критерий, p  0,05).

При этом степень отмеченных изменений выражена тем сильнее, чем меньше в ганглии остается функционирующих нХР, численность которых, как известно (Першин Б.Н., 1966; Скок В.И. и соавт.,1987; Бровцына Н.Б. и соавт., 1996), уменьшается с увеличением дозы ганглиоблокатора

Создаваемый блокадой дефицит макроэргов вместе с тем носит обра-тимый характер и в последующем, независимо от степени первоначально примененного блокирующего воздействия, содержание макроэргов начинает столь же последовательно увеличиваться (рис.6).

Рис.6. Последовательное увеличение содержания аденилатных макроэргов в симпатическом ганглии при разблокировании никотиновых холинорецеп-торов (нХР)

(К)  контроль; (Ч)  частичное и (П)  полное блокирование рецепторов, при применении доз ганглиоблокатора соответственно 10 и 50 мг/кг. При оценке достоверности различий средних применяли U критерий при p  0,05. На графиках показаны линии тренда линейной апроксимации.

При этом содержание аденилатов закономерно повышается вместе с постепенным восстановлением нормальной численности свободно функцио-нирующих нХР, что является естественным следствием ослабления и окон-чания синаптической блокады (Першин Б.Н., 1966; Скок В.И. и соавт., 1987; Бровцына Н.Б. и соавт., 1996).

Таким образом, характер динамики полученных сдвигов аденилатного пула макроэргов позволяют заключить, что синаптические нХР принимают закономерное участие в механизмах формирующих такой уровень содер-жания макроэргов, который обеспечивает необходимый энергетический баланс, отвечающий запросам нормально функционирующего симпати-ческого ганглия.

На основании полученных результатов впервые установлены законо-мерности, управляющие функциональной деятельностью краниального шей-ного симпатического ганглия. Суть этих закономерностей заключается в том, что, поступающий в ганглий через нейрональные никотиновые холинорецеп-торы афферентный информационный поток осуществляет включение и пос-ледующую модуляцию в ганглии определенных молекулярных и специфичес-ких клеточных механизмов (схема 1).

Синаптический сигнал через никотиновые холинорецепторы принимает участие в механизмах энергетического гомеостаза симпатического ганглия, обеспечивая управление базовым уровнем ключевых энергетических пара-метров - аденилатного пула макроэргов и ферментативной системы ЛДГ, активизирует и модулирует процессы синтеза белка в нейронах и окружа-ющих нейроны сателлитных глиоцитах.

Вместе с этим синаптический сигнал через никотиновые холино-рецепторы потенцирует в симпатическом ганглии специфическое клеточное взаимодействие – метаболическую интеграцию между симпатическим ней-

С И М П А Т И Ч Е С К И Й Г А Н Г Л И Й

ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ГОМЕОСТАЗ