Варбург, отто генрих (Warburg, Otto Heinrich) (1883-1970), немецкий биохимик и физиолог, удостоенный в 1931

Исследования Варбурга посвящены процессам клеточного дыхания, ферментам, окислительно-восстановительным реакциям в живой клетке. Уже в 1912 Варбург высказал предположение о существовании дыхательных ферментов, активирующих кислород. Показал, что клетки утилизируют кислород с помощью железосодержащих белков — гемопротеинов и в 1924 сообщил об открытии цитохром с-оксидазы — фермента, играющего ключевую роль в этом процессе. В 1932 вместе с У.Христианом впервые получил новый дыхательный фермент желтого цвета, названный флавином. Оказалось, что это представитель большой группы флавопротеинов — окислительных ферментов, образующих вместе с цитохрохромами дыхательную цепь. Три года спустя было выделено еще одно важное соединение — никотинамид, входящий в состав ферментов, которые участвуют в переносе водорода (дегидрогеназ).

Среди других работ Варбурга — определение структуры ферментов, исследование брожения, гликолиза в опухолевых тканях, фотосинтеза. Ученый сконструировал аппарат для изучения процессов тканевого дыхания, брожения, ферментативных реакций (аппарат Варбурга). Умер Варбург в (Западном) Берлине 1 августа 1970.

ОБЗОР

Современные аналитические методологии в лабораторной энзимологии

А.В. Козлов, доктор медицинских наук
Медицинская академия последипломного образования,
Санкт-Петербург, Россия

Использование оптического теста Варбурга, реакции Триндера, «самообнаруживающихся» субстратов, технологий «сухой» химии и «оптимизированных» методов привело к своеобразной унификации процессов химического анализа различных соединений в биологических жидкостях. Это расширяет возможности небольших лабораторий, поскольку позволяет проводить анализ многих клинически значимых показателей крови на недорогих анализаторах с использованием современных тест-систем.

Широкое использование определения активности ферментов в клинических лабораториях всего мира представляет собой одно из наиболее важных достижений современной медицины. От робких шагов в начале ХХ столетия, когда приступили к изучению активности пищеварительных ферментов в крови и моче, клиническая энзимология заняла соответствующее ей место в лабораторной медицине. Подобный прогресс обусловлен осознанием того, что активность многих ферментов может изменяться в зависимости от стадии заболевания [1].

Судя по частоте цитирования, около 20% публикаций в одном из наиболее авторитетных журналов – «Clinical Chemistry» посвящены вопросам клинической энзимологии, еще 20% публикаций – использованию ферментов в качестве аналитических реактивов [2]. Для сравнения: в первом номере упомянутого журнала за 1954 г. определению активности ферментов в качестве маркеров заболеваний человека были посвящены две публикации. Позднее стали появляться сообщения о возможности использования ферментов в качестве реактивов. Современные клинические лабораторные исследования не были бы возможны без достижений в данной области энзимологии. Сегодня в большинстве лабораторий более двух третей так называемых рутинных аналитов определяют с использованием ферментов. Это – в значительной степени результат изучения ферментов как катализаторов соответствующих реакций.

Одним из направлений современной клинической энзимологии является стремление к унификации аналитических методов обнаружения анализируемых компонентов [3]. В качестве примера можно привести широкое использование оптического теста Варбурга и сопряженных ферментативных реакций. Сам оптический тест был разработан О. Варбургом в конце 30-х годов ХХ века для определения активности НАД и НАДФ-зависимых дегидрогеназ. В его основу были положены различия спектров поглощения света восстановленной и окисленной формами кофермента НАД (никотинамидадениндинуклеотид). При длине волны 340 нм НАДН₂ и НАДФН₂ обладают способностью к поглощению света, тогда как НАД и НАДФ – практически его не поглощают (рис.1).

При разработке методов, основанных на оптическом тесте Варбурга, исходили из того, что максимум поглощения НАДН₂ и НАДФН₂ соответствует длине волны 340 нм, коэффициент молярного поглощения (ε) при данной длине волны принимали равным 6220 л моль^-1 см^-1. Позднее было установлено, что на величину молярного поглощения данных коферментов влияют многие факторы. В частности, длина волны максимума поглощения незначительно сдвигается при повышении температуры, пик поглощения расширяется. При повышении температуры величина поглощения, измеряемая при фиксированной длине волны, снижается. Величина ε возрастает при увеличении рН, при повышении ионной силы раствора значение ε снижается. В связи с этим в настоящее время производители современных анализаторов рекомендуют проводить измерения при длине волны 339 нм и для расчетов значение коэффициента молярного поглощения принимать равным 6300 лмоль^-1 см^-1 [4].

Различают прямой и непрямой оптический тест Варбурга. В прямом оптическом тесте в инкубационную среду добавляют кофермент НАД или НАДН₂, буферный раствор, источником фермента служит исследуемый материал – чаще всего сыворотка или плазма крови. В зависимости от выбранных условий (в данном случае значение рН) реакция, катализируемая ферментом (в данном случае лактатдегидрогеназой – ЛДГ), может протекать в обоих направлениях (рис. 2):

Непрямой оптический тест Варбурга включает в себя, помимо основной реакции, индикаторную и вспомогательные реакции. Типичным примером такого типа реакции может служить используемый для определения активности аланинаминотрансферазы (АлАТ) вариант сопряжения этих реакций (рис. 3).

В связи с тем, что выпуск высокоочищенных препаратов НАД и НАДН₂, не содержащих различные ингибиторы, успешно осуществляется большинством компаний – производителей реактивов, оптический тест Варбурга широко используется для определения как содержания низкомолекулярных компонентов, так и активности многих ферментов.

В настоящее время активность большинства ферментов, в том числе АсАТ и АлАТ, в сыворотке в подавляющем большинстве зарубежных лабораторий определяют методами непрерывной регистрации (кинетическими).

Как видно из представленных в таблице данных, методы, разработанные и предложенные различными научными обществами и ассоциациями, различаются по ряду параметров: концентрации субстрата, типу буферного раствора (ТРИС или фосфатный) и температуре реакции. При выборе условий реакции авторы стремились подобрать оптимальное соотношение между компонентами инкубационной среды, определяющими скорость реакции. В так называемых “оптимизированных” методах определение аминотрансферазной активности исследуемого образца проводят в присутствии кофермента аминотрансфераз пиридоксаль-5’-фосфата ( П-5’-Ф).

Несмотря на различия, используемая концентрация субстрата обеспечивает скорость реакции в пределах 96% от теоретических значений V_max.

Достоинством данной реакции является то, что образующийся продукт обладает поглощением в видимой области спектра и для фотометрического определения не требуется дорогостоящий фотометр. Данную реакцию широко используют для определения многих низкомолекулярных соединений и активности ряда ферментов. Обязательным условием для ее протекания является использование в качестве основных ферментов высокоочищенных препаратов оксидаз, при действии которых в инкубационной среде образуется эквимолярное окисленному субстрату количество перекиси водорода.

Стремление стандартизировать и упростить определение активности α-амилазы привело к синтезу п-нитрофенил-замещенных гликозидов. При гидролизе таких субстратов α-амилазой и α-глюкозидазой в качестве вспомогательного фермента в среде инкубации образуется п-нитрофенол, что позволяет определять активность α-амилазы путем непрерывной регистрации (рис. 6).

Примером могут служить следующие методы, основанные на использовании К-активируемых ферментов – триптофаназы и пируваткиназы [7, 8].

В основной реакции (1), катализируемой К-зависимой триптофаназой, образуются ионы NH4⁺. Их появление в среде инкубации запускает индикаторную реакцию, катализируемую ферментом глютаматдегидрогеназой, приводящую к уменьшению поглощения при 340 нм вследствие превращения НАДФН₂ в НАДФ. Величина изменения поглощения определяется концентрацией калия в исследуемом образце жидкости.

Определение калия при участии К-зависимой пируваткиназы является более сложной аналитической процедурой. Пируваткиназа способна активироваться ионами аммония, содержащимися в исследуемом материале. В связи с этим на предварительном этапе его выводят из инкубационной среды с использованием реакции, катализируемой ферментом глютаматдегидрогеназой (реакция 2 на рис. 7). Ввиду того, что концентрация натрия в плазме во много раз превышает концентрацию калия, его корректное определение возможно при условии связывания большей части ионов натрия. Их связывание осуществляют с помощью криптанда с патентованным названием «Kriptofix» в реакции:

Только после окончания этих реакций концентрацию калия определяют с помощью сочетанных реакций (рис. 8), где реакция 1 выступает в роли основной, а реакция 2 – индикаторной. Величина изменения поглощения определяется концентрацией калия в исследуемом образце жидкости.

Линейная зависимость наблюдается в интервале концентраций 1–8 ммоль/л. Метод адаптирован к автоанализаторам. Коэффициент вариации колеблется в пределах 1,5%.

Фотометрический метод определения натрия основан на его способности активировать фермент β-галактозидазу, гидролизирущий субстрат – о-нитрофенил-β-D-галактоприранозид до галактозы и о-нитрофенола. Скорость образования о-нитрофенола в среде инкубации зависит от содержания натрия в исследуемом образце.

Результаты, получаемые с использованием приведенных ферментных методов, сопоставимы с результатами, полученными при использовании пламенной фотометрии [7].

Первые попытки создания диагностических полосок были предприняты в конце XIX столетия в Англии и Германии. К середине 40-х годов ХХ века были разработаны готовые формы для определения методами «сухой химии» многих параметров мочи. Появление приборов, работающих на принципе отражательной фотометрии, позволило использовать диагностические полоски не только для качественной, но и полуколичественной оценки результатов исследования мочи.

Прогрессом в области использования реагентных полосок следует считать разработку целого ряда методов определения биохимических показателей как в сыворотке, так и цельной крови. Кроме того, созданы портативные приборы как целевого назначения – глюкометры для определения уровня глюкозы в крови, так и мультианализаторы типа «Рефлотрон» для экспресс-анализа не менее 20 различных показателей.

Дальнейшее развитие отражательной фотометрии и химии сухих реагентов на диагностических полосках привело к созданию высокопроизводительных автоанализаторов, способных в режиме «random access» определять большое число параметров цельной крови без предварительной подготовки образцов.

Современные диагностические полоски представляют собой сложную многослойную систему, позволяющую не только отделять плазму от форменных элементов путем диффузии жидкой части крови в слои, содержащие реагенты, но и обеспечивать протекание сложных сопряженных реакций в небольшом объеме жидкости.

Достоинствами отражательной фотометрии с применением диагностических полосок являются: малый объем жидкости, возможность использования цельной крови, относительная простота и быстрота проведения анализа, длительный срок хранения полосок.

За последние десятилетия произошли значительные изменения в структуре лабораторных методов за счет внедрения новых технологий. В связи с этим произошло переосмысление сложившихся представлений о значении определения активности ферментов в постановке клинического диагноза. Традиционно смысл определения активности ферментов сводился к выявлению заболеваний сердца, печени, поджелудочной железы, скелетных мышц, костной ткани и предстательной железы. До сих пор определение активности ферментов остается значимым, однако акценты сместились к новым аспектам их диагностического применения.

Ферменты в диагностике заболеваний сердечной мышцы
До настоящего времени определение активности ферментов широко использовалось для подтверждения диагноза острого инфаркта миокарда (ОИМ). В настоящее время на эту роль претендует определение специфических сердечных маркеров – тропонина Т или тропонина I. Несмотря на это, определение изоформ креатинкиназы или ее изофермента КК-МВ остается применимым для ранней диагностики ОИМ – в пределах 12 часов от начала заболевания. В этот период диагностическая чувствительность определения не намного уступает чувствительности определения TnT. Наряду с определением уровня тропонина, определение изоформ КК-ММ и КК-МВ позволяет следить за восстановлением коронарного кровотока на ранней стадии инфаркта миокарда. Определение изоформ КК может быть использовано для оценки времени начала ОИМ, когда клинические данные не позволяют выявить его точно [9].

Определение активности изофермента КК-МВ имеет преимущество по сравнению с определением тропонина из-за возможности круглосуточного определения, простоты и скорости определения и относительно низкой стоимости.

Интерес к применению ферментов в диагностике не ограничивается сывороточными ферментами. Определение ферментативной активности проводят в таких биологических жидкостях, как спинномозговая, моча, амниотическая, синовиальная и др., а также в клетках крови и других тканей при исследовании биопсийного материала.

ЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА

в биологическом материале

Определение общего белка в сыворотке крови

по биуретовой реакции

Метод относительно дешев, прост, обладает хорошей воспроизводимостью и специфичностью, использование его позволяет выполнять исследование как на анализаторах (автоматических и полуавтоматических), так и на обычном фотометре.

РЕЗЮМЕ
Описан метод определения железа в сыворотке крови человека, рекомендованный Международным комитетом по стандартизации в гематологии в качестве референтного, в современной модификации. В качестве хромогена использован феррозин. Подробно изложена методика определения, особое внимание уделено подготовке отечественных реактивов для достижения необходимого уровня качества.

Референтный метод может быть использован для оценки качества разрабатываемых методов определения железа, может быть рекомендован в качестве рутинного анализа.

SUMMARY
Referent method of iron detection in plasma

Содержание железа в сыворотке крови является важным критерием в диагностике ряда гематологических заболеваний, связанных с нарушением метаболизма железа в организме, и, в первую очередь, в дифференциальной диагностике анемий различного происхождения.

В настоящее время в лабораторной практике используется большое число различных методов определения железа в сыворотке крови. Однако Международный комитет по стандартизации в гематологии (ICSH) рекомендует в качестве референтного метода лишь один, который был впервые описан ICSH в 1971 г. [1], затем в 1978 г. [2] и, наконец, в 1990 г. [3]. Предложенные экспертным советом ICSH рекомендации, опубликованные в 1971 г. [1] в качестве экспериментального стандартного метода определения железа в сыворотке крови и сообщенные в 1972 г. [4] детали исследований, проведенных членами этого совета, касались и реагентов и способа определения. Метод был рекомендован для рутинного анализа и реализован, например, в широко известном в России наборе реактивов фирмы LaChema (Чехия). По этому методу 2 мл сыворотки смешивали с 2 мл кислого рабочего раствора, содержащего трихлоруксусную, тиогликолевую и соляную кислоты и выдерживали при комнатной температуре; при этом железо высвобождалось из железосвязывающих белков сыворотки крови и восстанавливалось до двухвалентного состояния. Затем белки удалялись с помощью центрифугирования, а к супернатанту прибавлялся раствор хромогена — динатриевой соли 4,7-дифенил-1,10-фенантролиндисульфоновой кислоты (батофенантролина) в присутствии ацетата натрия для создания в реакционной смеси значения рН 4,5, оптимального для образования окрашенного комплекса, оптическая плотность которого определялась при 535 нм.

В дальнейшем, с учетом последующих исследований членов совета, а также комментариев, полученных от различных организаций и ученых, вышеописанные рекомендации были пересмотрены и опубликованы в 1978г. [2] в качестве ICSH стандарта (ЕР7/1978). Дополнительно было введено нагревание смеси сыворотки с кислым реагентом при 56 оС в течение 15 мин и уменьшение концентрации соляной кислоты с соответствующим уменьшением концентрации ацетата натрия в растворе хромогена.

Через 12 лет ICSH опубликовал [3] вновь пересмотренные рекомендации для измерения сывороточного железа, которые включали замену хромогена и уменьшение объема сывороточной пробы. Ранее было показано, что мононатриевая соль 3-(2-пиридин)-5,6-дифенил-1,2,4-триазин-n,n1-дисульфокислоты (феррозин) и динатриевая соль 3-(2-пиридил)-5,6-бис[2-(5-сульфурил)]-1,2,4,-триазина (ферен) являются более чувствительными хромофорами: феррозин — на 25 %, а ферен — на 50 %, и, при этом, более дешевыми [5]. Определению железа не препятствовали ни билирубин, ни каротин, а степень погрешности, обусловленная наличием гемоглобина, была аналогична той, что описана для батофенантролина. С рекомендованным восстанавливающим реагентом, тиогликолевой кислотой, наблюдалась очень небольшая погрешность (< 5%) за счет ионов меди, присутствующих в сыворотке. Уменьшение объемов сыворотки и реагентов в 4 раза (от 2 до 0,5 мл) не вредило точности и воспроизводимости, когда в качестве хромогенов применялись феррозин (коэффициент вариации 1,3 %) или ферен (коэффициент вариации 2,1 %). Особые требования в этом методе предъявляются к используемым реактивам: содержание железа в них должно быть минимальным, так как от этого зависит оптическая плотность холостой пробы, которая по рекомендациям ICSH не должна превышать 0,015 ед. оптической плотности.

Целью данной работы являлось апробация современного референтного метода определения железа в сыворотке крови человека с использованием реактивов отечественного производства. Особое внимание было уделено очистке реактивов в соответствии с указаниями в рекомендациях ICSH [2].

Стандартный раствор железа с содержанием 500 мкг железа в 100 мл (89,5 мкмоль/л) в присутствии гидроксиламина, Sigma (США).

Определение оптических плотностей растворов проводили на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, Россия) в кюветах с длиной оптического пути 1 см.

Вода бидистиллированная для проведения всех этапов работ содержала менее 0,2 мкмоль железа в 1 л (1,1 мкг/100 мл). Пригодной является вода, перегнанная в стеклянном оборудовании. Если перегонка воды происходит иначе, она может быть в дальнейшем очищена путем пропускания через деионизатор, содержащий активированный уголь и подходящую ионообменную смолу.

Используемое стеклянное оборудование (пробирки, флаконы, бутылки), освобождали от железа замачиванием в 2 М HCl в течении 6 часов и промывали от кислоты свободной от железа водой.

Соляную кислоту, содержащую менее 5 мкмоль железа на 1 л (28 мкг/100 мл), получали перегонкой в стеклянном оборудовании и первые 20% дистиллята отбрасывались. Собирали и, затем, использовали дистиллят с температурой кипения 106—108° С, представляющий собой азеотропный раствор с плотностью р = 1,1 г/см3 , содержащий 6 моль/л HCl в 1 л [6].

Трихлоруксусную кислоту с содержанием железа менее чем 5 мкмоль/кг (280 мкг/кг), получали перегонкой в стеклянном оборудовании, предварительно освобожденном от железа перегонкой 200 мл соляной кислоты. Оборудование промывалось водой от кислоты и высушивалось перед использованием. При перегонке трихлоруксусной кислоты (200 г) первые 25 г дистиллята отбрасывали. Следующие примерно 150 г с температурой кипения 196—198° С собирали в предварительно тарированные флаконы, которые затем можно хранить в эксикаторе над твердым едким кали.

Тиогликолевую кислоту очищали перегонкой под вакуумом; Ткип =123° С при 35 мм рт.ст. Полученная кислота имела концентрацию 13,4 моль/л (определяли титрованием).

Уксуснокислый натрий очищали от железа следующим образом [7]: 500 г СН3СООNa ? 3Н2О растворяли в дистиллированной воде (общий объем 1 л) при 37° С и отфильтровывали мутный желтоватый раствор через плотный бумажный фильтр до получения прозрачного бесцветного раствора. Такой раствор содержит 3,6 моль/л уксуснокислого натрия.

Приготовление рабочих растворов
1. Депротеинирующий раствор, содержащий 0,6 моль/л трихлоруксусной, 0,4 моль/л тиогликолевой и 1 моль/л соляной кислот готовили из 30 мл перегнанной тиогликолевой кислоты, 165 мл перегнанной соляной кислоты (азеотропная смесь), 100 г перегнанной трихлоруксусной кислоты и воды в мерной колбе на 1 л. Раствор стабилен, по крайней мере, 2 месяца при хранении в темной стеклянной посуде при 2—8° С.

2. Раствор хромогена, содержащий 1,5 М уксуснокислого натрия и 0,5 ммоль/л (0,25 г/л) феррозина готовили из 420 мл очищенного раствора уксуснокислого натрия, 250 мг феррозина и воды до 1 л.

К 1 мл каждого из растворов добавляли по 1 мл раствора хромогена, энергично перемешивали, выдерживали 10 мин и измеряли оптическую плотность опытной и калибровочной пробы при 560 нм против холостой пробы.

Количество железа определяли по формуле:

                                            D сыв

Очень важным моментом при анализе является отсутствие гемолиза в сыворотке. Дело в том, что при референтном методе определения железа в гемолизированной сыворотке, железо из гемоглобина частично входит в определяемую величину, значительно ее завышая.

Другим важным моментом при определении железа в сыворотке крови является величина оптической плотности холостой пробы на реактивы. По рекомендациям ICSH она не должна превышать 0,015 е.о.п. [2]. Это ограничение обусловлено стремлением уменьшить возможные ошибки при определении железа в сыворотке крови больных при анемиях и других заболеваниях, связанных с недостатком железа в организме, когда содержание железа в сыворотке очень низкое, например 3—5 мкмоль/л.

Проведенные нами опыты (результаты приведены в табл.1) показали зависимость оптической плотности холостой пробы (D560) от чистоты используемых реактивов, причем при использовании перегнанных реактивов, как описано выше, А560 уменьшается в 10 раз.

Таблица 1

Реактивы, использованные для депротеинирующего раствора
	Трихлоруксусная кислота	Соляная кислота	Тиогликолевая кислота	D 560
1	коммерческая	коммерческая	коммерческая	0,103
2	перегнанная	перегнанная	коммерческая	0,041
3	перегнанная	перегнанная	перегнанная	0,010–0,015

Величина оптической плотности образца, содержащего стандартный раствор железа (500 мкг/дл; 89,5 мкмоль/л) при разведении в два раза, входящая в формулу, по которой вычисляют количество железа составила 0,300 е.о.п. (КВ = 2,5%). Средняя величина содержания железа в сыворотке доноров составила 17 мкмоль/л (n=36), распределенная в интервале 3—32 мкмоль/л (Рис.1). При этом оптическая плотность составляла соответственно 0,114 (0,020—0,214). Коэффициент вариации составлял 3—10 % и зависел от вида сыворотки и содержания в ней железа. При анализе контрольной сыворотки «Биоконт-С» с содержанием железа 20—25 мкмоль/л коэффициент вариации составлял не более 5 %.

В методических рекомендациях, как международных [2], так и отечественных [7], стандартный раствор железа предлагается готовить путем растворения точной навески проволоки чистого железа в очищенной соляной кислоте с дальнейшим точным разведением. Нами полагается нецелесообразным приготовление такого стандарта в условиях клинической лаборатории ввиду его трудоемкости и возможности внесения неконтролируемой систематической ошибки. Вполне доступны коммерческие, стандартные и калибровочные растворы железа, как импортного, так и отечественного производства. Как правило, такие растворы содержат гидроксиламин в качестве стабилизатора.

Таким образом, хотя референтный метод ICSH достаточно трудоемкий, он может быть рекомендован в качестве рутинного анализа, но лишь с учетом специфической очистки и подготовки отечественных реактивов. Кроме того, в качестве референтного, он может быть использован для оценки качества других методов определения содержания железа в сыворотке крови.

Для определения концентрации фосфора

неорганического используют образование

фосфомолибдатного комплекса, который затем

окисляется до голубого молибденового комплекса.

Методы отличаются по используемым окисляющим

агентам: хлорид олова, фенилгидразин,

аминонафтолсульфоновая кислота, аскорбиновая

кислота, ρ-метиламинофенолсульфат, N-фенил-ρ-

фенилендиамин и сульфат железа. Эти методы

обладают следующими недостатками:

нестабильность окрашивания, необходимость

проводить депротеинизацию и сложность в

проведении процедуры. Добавление сурфактанта

позволило избежать процедуры подготовки

фильтрата, свободного от белка, увеличить

интенсивность окрашивания и упростить процедуру

проведения анализа. Многие из компонентов,

используемых для проведения реакции очень

нестабильны, поэтому их надо хранить отдельно.

Количественный метод измерения неокисленного

фосфомолибдатного комплекса впервые был описан

Simonsen и соавт. в 1946 году. В 1972 году Daly и

Ertingshausen адаптировали эту методику для

определения неорганического фосфора. Через

некоторое время Amador и Urban модифицировали

методику. Настоящий метод - это модификация теста.

Методика проста в проведении, используются

стабильные реагенты, измерение проводится в

ультрафиолетовой части спектра.

Неорганический фосфор + H2SO4 + молибдат аммония ----------��

Неокисленный фосфомолибдатный комплекс

В кислой среде неорганический фосфор реагирует с

молибдатом аммония, при этом формируется

фосфомолибдатный комплекс. Абсорбция измеряется

при 340 нм и пропорциональна концентрации

неорганического фосфора в исследуемом образце.



Метод определения общего холестерина в сыворотке крови, основанный на реакции Либермана—Бурхарда (метод Илька)