,3-Bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea enhances the inhibitory effect of Resveratrol on 5-fluorouracil sensitive/resistant colon cancer cells

1,3-Bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea enhances the inhibitory effect of Resveratrol on 5-fluorouracil sensitive/resistant colon cancer cells.

• 
  ¹Dipon Das, Ranjan Preet, Purusottam Mohapatra, Shakti Ranjan Satapathy, Chanakya Nath Kundu, Cancer Biology Division, KIIT School of Biotechnology, KIIT University, Bhubaneswar, Odisha 751024, India.
  

METHODS:

We established and characterized a 5-FU resistance (5-FU-R) cell line derived from continuous exposure (25 μmol/L) to 5-FU for 20 wk in 5-FU sensitive HCT-116 cells. The proliferation and expression of different representative apoptosis and anti-apoptosis markers in 5-FU sensitive and 5-FU resistance cells were measured by the MTT assay and by Western blotting, respectively, after treatment with Resveratrol (Res) and/or 1,3-Bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea (BCNU). Apoptosis and cell cycle arrest was measured by 4',6'-diamidino-2-phenylindole hydrochloride staining and fluorescence-activated cell sorting analysis, respectively. The extent of DNA damage was measured by the Comet assay. We measured the visible changes in the DNA damage/repair cascade by Western blotting.

RESULTS:

The widely used chemotherapeutic agents BCNU and Res decreased the growth of 5-FU sensitive HCT-116 cells in a dose dependent manner. Combined application of BCNU and Res caused more apoptosis in 5-FU sensitive cells in comparison to individual treatment. In addition, the combined application of BCNU and Res caused a significant decrease of major DNA base excision repair components in 5-FU sensitive cells. We established a 5-FU resistance cell line (5-FU-R) from 5-FU-sensitive HCT-116 (mismatch repair deficient) cells that was not resistant to other chemotherapeutic agents (e.g., BCNU, Res) except 5-FU. The 5-FU resistance of 5-FU-R cells was assessed by exposure to increasing concentrations of 5-FU followed by the MTT assay. There was no significant cell death noted in 5-FU-R cells in comparison to 5-FU sensitive cells after 5-FU treatment. This resistant cell line overexpressed anti-apoptotic [e.g., AKT, nuclear factor κB, FLICE-like inhibitory protein), DNA repair (e.g., DNA polymerase beta (POL-β), DNA polymerase eta (POLH), protein Flap endonuclease 1 (FEN1), DNA damage-binding protein 2 (DDB2)] and 5-FU-resistance proteins (thymidylate synthase) but under expressed pro-apoptotic proteins (e.g., DAB2, CK1) in comparison to the parental cells. Increased genotoxicity and apoptosis were observed in resistant cells after combined application of BCNU and Res in comparison to untreated or parental cells. BCNU increased the sensitivity to Res of 5-FU resistant cells compared with parental cells. Fifty percent cell death were noted in parental cells when 18 μmol/L of Res was associated with fixed concentration (20 μmol/L) of BCNU, but a much lower concentration of Res (8 μmol/L) was needed to achieve the same effect in 5-FU resistant cells. Interestingly, increased levels of adenomatous polyposis coli and decreased levels POL-β, POLH, FEN1 and DDB2 were noted after the same combined treatment in resistant cells.

CONCLUSION:

BCNU combined with Res exerts a synergistic effect that may prove useful for the treatment of colon cancer and to overcome drug resistance.

1,3-Бис(2-хлорэтил)-1-nitrosourea усиливает ингибирующее влияние Ресвератрола на 5-фторурацил чувствительных/резистентных клеток рака толстой кишки.
Исследование механизма 5-фторурацил (5-ФУ) сопротивление клеток рака толстой кишки и для разработки стратегий, направленных на преодоление такого сопротивления при комбинированной терапии.
МЕТОДЫ:Мы установили и характеризовал 5-ФУ сопротивление (5-ФУ-R) клеточных линий, полученных от непрерывного воздействия (25 мкмоль/Л) и 5-ФУ в течение 20 wk в 5-ФУ чувствительных HCT-116 клеток. Распространение и выражения различных представитель апоптоза и анти-маркеров апоптоза в 5-ФУ чувствительной и 5-ФУ резистентность клеток были измерены с помощью МТТ-теста и с помощью Вестерн-блоттинга, соответственно, после лечения с Ресвератрол (Res) и/или 1,3-Бис(2-хлорэтил)-1-nitrosourea (BCNU). Апоптоза и клеточного цикла измеряли 4',6'-diamidino-2-phenylindole гидрохлорид окрашивание и флуоресценции-активированный келье анализ, соответственно. Степень повреждения ДНК, была измерена с помощью метода ДНК-Комет. Мы измерили видимых изменений в повреждений ДНК/ремонт каскада с помощью Вестерн-блоттинга.
РЕЗУЛЬТАТЫ:Широко используется химиотерапевтических агентов BCNU и Res снизился рост 5-ФУ чувствительных HCT-116 клеток в зависимости от дозы образом. Комбинированное применение BCNU и Res вызвало больше апоптоза в 5-ФУ чувствительных клеток в сравнении с индивидуального лечения. Кроме того, совместное использование BCNU и Res обусловило значительное снижение основных эксцизионной репарации ДНК компонентов в 5-ФУ чувствительных клеток. Мы создали 5-ФУ сопротивление клеточной линии (5-ФУ-R) с 5-FU-чувствительных HCT-116 (несоответствие ремонт дефицитных) ячейками, который не был устойчивые к другим химиотерапевтическим агентам (напр., BCNU, Res), за исключением 5-ФУ. 5-ФУ сопротивление 5-ФУ-R клеток оценивали воздействие повышения концентрации 5-ФУ следуют МТТ-теста. Не было никаких существенных клеточной смерти отмечено в 5-ФУ-R клеток в сравнении с 5-FU чувствительных клеток после 5-ФУ лечения. Этот упорный клеточной линии overexpressed антиапоптозных [напр., AKT, ядерный фактор κB, FLICE, как ингибирующих белковый), репарации ДНК (напр., ДНК-полимеразы бета (POL-бета), ДНК-полимеразы, eta (POLH), белка Лоскут эндонуклеазы 1 (FEN1), повреждения ДНК-связывающий белок, 2 (DDB2)] и 5-ФУ-сопротивление белков (тимидилат-синтазы), но под выразил pro-белков апоптоза (напр., DAB2, CK1) по сравнению с родительской клетки. Увеличение генотоксичность и апоптоза наблюдались в резистентных клеток после комбинированного применения BCNU и Res по сравнению с простым или родительских клеток. BCNU повышенная чувствительность к Res 5-ФУ резистентных клеток по сравнению с родительской клетки. Пятьдесят процентов клеточной смерти были отмечены в родительских клеток, когда 18 мкмоль/Л Res был связан с фиксированной концентрации (20 мкмоль/Л) BCNU, но гораздо более низкой концентрации Res (8 мкмоль/Л), были необходимы для достижения того же эффекта в 5-ФУ резистентных клеток. Интересно, что повышенные уровни аденоматозный полипоз coli и снижение уровня POL-бета, POLH, FEN1 и DDB2 были отмечены же после комбинированного лечения резистентных клеток.
ВЫВОД:BCNU в сочетании с Res оказывает синергетический эффект, который может оказаться полезным для лечения рака толстой кишки и преодоления лекарственной резистентности.

жүктеу/скачать 2.08 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: