Дифференцировка и поведение нейральных стволовых клеток человека в культуре ткани и при трансплантации в головной мозг крыс

Специальность 03.00.30. – биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2006

Работа выполнена в лаборатории экспериментальной нейробиологии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Директор Института – доктор биологических наук, профессор Н.Д. Озернюк

Научный руководитель:

доктор биологических наук М.А. Александрова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.Я. Бродский (ИБР РАН)

доктор биологических наук А.В. Куликов (ИТЭБ РАН)

Ведущая организация:

Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится 2006 г. в часов.

На заседании Диссертационного совета Д 002.238.01 при Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26.

Факс: (495) 135-80-12

E-mail: volina@proxima.idb.ac.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26.)

Автореферат разослан « » 2006 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

кандидат биологических наук Е.В. Волина

Существенным шагом в изучении стволовых клеток стало их выделение и культивирование. В культуре in vitro стволовые клетки активно размножаются в условиях бессывороточных сред с ростовыми факторами, формируя свободноплавающие колонии шарообразной формы, которые называются нейросферами (Reynolds and Weiss, 1992; Lois and Alvarez-Buylla, 1993; Palmer et al., 1995; Weiss et al., 1996). Клонирование нейросфер дало инструмент для установления свойства «стволовости» у тех или иных первичных популяций нейральных клеток. Именно с помощью этого подхода было продемонстрировано, что некоторые области развивающегося и зрелого мозга млекопитающих, включая человека, содержат пулы нейральных стволовых клеток (Reynolds and Weiss, 1996; Carpenter et al., 1999; Kukekov et al., 1999; Pagano et al., 2000; Vescovi et al., 1999).

С одной стороны, культивирование нейральных стволовых клеток позволяет по-новому подойти к проблемам исследований дифференцировки клеток нервной системы, а с другой – развить идею о применении клеточной терапии для лечения различных патологий центральной нервной системы.

Проведенные многочисленные исследования показали, что культуры нейральных стволовых клеток гетерогенны (Mokry et al., 1996; Carpenter et al., 1999; Kukekov et al., 1999; Vescovi et al., 1999; Suslov et al., 2002; Bez et al., 2003; Lobo et al., 2003), и эта гетерогенность обусловлена многими факторами. По этой причине такие культуры стали называть популяциями нейральных стволовых/прогениторных клеток (НСПК^). Здесь возникает вопрос о стандартизации методов их выращивания и способов получения их характеристик. Этот вопрос является особенно принципиальным по отношению к культурам клеток человека. Кроме того, анализ культур in vitro может быть недостаточным для оценки их потенциальной значимости для практического применения, и поэтому необходимо учитывать результаты трансплантационных исследований на моделях повреждений мозга у животных.

Нейротрансплантация уже достаточно давно рассматривается как перспективный подход для коррекции патологических состояний мозга. В 70-х и 80-х годах прошлого столетия эксперименты с трансплантацией эмбриональной нервной ткани показали большую эффективность этого подхода как в фундаментальных вопросах нейральной дифференцировки, так и для практических целей. На сегодняшний день именно пересадка культур нейральных стволовых клеток стала новым этапом развития направления, связанного с нейротрансплантацией (Svendsen et al., 1996; Lundberg et al., 1997; Snyder et al., 1997; Brock et al., 1998; Fricker et al., 1999; Vescovi et al., 1999; Auerbach et al., 2000; Rubio et al., 2000; Akiyama et al., 2001; Ogawa et al., 2002; Enomoto et al., 2003). Анализ переживания и поведения клеток после трансплантации, а также их влияния на компенсаторные процессы на экспериментальных моделях повреждения мозга у животных является основной задачей исследований по нейротрансплантации.

Однако для предполагаемого практического использования клеточных культур существует некоторые проблемы. Получение культур нейральных стволовых клеток для аутотрансплантации является фактически невыполнимой задачей, в связи с тем, что нет возможности доступа к областям зрелого мозга человека, из которых такие клетки могут быть выделены. Другая проблема носит этический характер. Это выделение нейральных стволовых клеток из образцов тканей мозга эмбрионов человека, полученных путем медицинского аборта. По этой причине возникла задача поиска альтернативных источников нейральных клеток. С развитием представлений о стволовых клетках, присутствующих практически во всех органах и тканях, появилась концепция «пластичности стволовых клеток», которая заключается в том, что при определенных условиях стволовая клетка данной ткани способна давать потомков с нетипичными ветвями дифференцировки. В частности, имеются данные о том, что мезенхимные стволовые клетки (МСК) стромы костного мозга могут развиваться по нейральному пути как in vitro, так и при трансплантации в центральную нервную систему (Azizi et al., 1998; Kopen et al., 1999; Nakano et al., 2001; Priller et al., 2001; Munoz-Elias et al., 2004). Эти данные в корне меняют представления о процессах развития и дифференцировки клеток в организме. Однако результаты многих таких исследований все-таки можно поставить под сомнение.

Многочисленные работы по проблеме нейральных стволовых клеток концентрируют свой взгляд в основном либо на анализе клеточных культур, либо на изучении результатов трансплантации. По этой причине возникает необходимость в проведении исследования, которое захватило бы оба аспекта проблемы. Кроме того, появившиеся в последнее время работы, в которых авторы демонстрируют нейральную дифференцировку культур мезенхимных стволовых клеток после трансплантации в мозг, требуют тщательной проверки. Вследствие этого, именно параллельный анализ культур нейральных и мезенхимных стволовых клеток in vitro и при трансплантации позволит прояснить ситуацию в данной проблеме.

Цель исследования. Цель настоящей диссертационной работы состояла в изучении дифференцировки и поведения в культурах нейральных стволовых/прогениторных клеток развивающегося мозга человека in vitro и после трансплантации в мозг крыс.

Задачи исследования.

1. 
   С использованием гистологических и иммуногистохимических методов охарактеризовать культуры НСПК развивающегося мозга человека.
   
2. 
   Проанализировать судьбу (дифференцировку, пролиферацию и миграцию) трансплантированных клеток из культур НСПК эмбрионального мозга человека и их взаимодействие с тканями нормального и патологического мозга реципиентов.
   
3. 
   Изучить влияние трансплантатов культур НСПК эмбрионального мозга человека на поведение крыс, подвергнутых острой гипоксии, и на гистологическую картину нейродегенеративных процессов.
   
4. 
   Проанализировать культуру МСК стромы костного мозга человека и переживание клеток этой культуры после трансплантации в головной мозг нормальных крыс и крыс с острой гипоксией.
   

Впервые в рамках одной работы детально были охарактеризованы с помощью методов гистологии, иммуногистохимии и электронной микроскопии культуры нейральных стволовых/прогениторных клеток эмбрионального мозга человека, и затем была исследована судьба этих охарактеризованных культур после трансплантации в мозг крыс. Анализ клеточных культур показал, что они гетерогенны. Нейросферы включают клетки, находящиеся на разных этапах нейральной дифференцировки. Рост клеточной культуры обеспечивается за счет стволовых, прогениторных и глиальных клеток. Иммуногистохимическое исследование адгезивных нейросфер показало, что многие клетки могут одновременно экспрессировать маркеры предшественников и дифференцированных клеток. Культивирование нейросфер на бессывороточной среде с митогенами позволяет получить популяцию клеток только нейрального ряда. Впервые на модели диффузного повреждения мозга у крыс было продемонстрировано, что после трансплантации клеточных культур происходит нормализация поведения и улучшается выживаемость собственных нейронов мозга реципиента. Это указывает на то, что трансплантаты культур нейральных стволовых/прогениторных клеток изменяют среду микроокружения патологического мозга, предотвращая гибель затронутых повреждением нейронов. Анализ переживания самих трансплантатов показал, что клетки человека сохраняются как минимум 27 дней после операции у животных без иммуносупрессии. В трансплантатах выявляются клетки на разных этапах дифференцировки: стволовые и прогениторные клетки, нейробласты и глиобласты. Однако дифференцированных нейронов выявлено не было. Трансплантированные клетки мигрируют по тканям мозга реципиента, часто вдоль капилляров.

Используя методические подходы, аналогичные тем, которые применяли для исследования нейральных клеток, был проведен анализ культуры мезенхимных стволовых клеток человека in vitro и при трансплантации. Здесь впервые были получены убедительные данные о том, что нативные мезенхимные стволовые клетки не дифференцируются в нейральном направлении в среде микроокружения зрелого мозга. Трансплантаты отторгаются с практически полной элиминацией клеток к 20-ым суткам. Вокруг трансплантатов развивается мощная глиальная реакция, и наблюдаются сильные морфологические изменения в окружающей ткани. В тоже время синтезируемый трансплантированными клетками фибронектин, по-видимому, обеспечивает врастание нервных волокон хозяина в область трансплантата.

Таким образом, полученные результаты служат важным звеном между фундаментальными проблемами биологии стволовых клеток (такими как дифференцировка, роль микроокружения в процессах дифференцировки клеток и регенерации в нервной системе, пластичность стволовых клеток) и клеточной терапией центральной нервной системы.

Материалы настоящей диссертации могут быть использованы в курсах лекций в биологических и медицинских ВУЗах.

В работе было исследовано восемь культур НСПК. При культивировании на бессывороточной среде с митогенами на 5-7 сутки во всех исследованных культурах отмечали появление нейросфер. По мере культивирования нейросферы увеличивались в размере за счет пролиферации клеток в них и представляли собой шаровидные структуры, содержащие 100 и более клеток (Рис. 1). Размеры нейросфер варьировали от 50 мкм до 500 мкм и более в диаметре.

Иммуногистохимические исследования нейросфер показали, что они включают клетки, находящиеся на различных этапах нейральной дифференцировки (Рис. 2). Морфологический анализ полутонких срезов нейросфер свидетельствовал о том, что среди хаотически распределенных клеток встречаются группы клеток организованные в розетко-подобные структуры (Рис. 3). Тела клеток в розетках имеют уни- или биполярную форму и располагаются радиально на некотором расстоянии от центра. Ядра клеток лежат, как правило, в несколько слоев. В центре розетки - полость, к которой сходятся апикальные отростки составляющих ее клеток. Апикальные отростки вблизи центральной полости соединены протяженными десмосомоподобными контактами. В розетках часто встречаются митотически делящиеся клетки. Ядра делящихся клеток находятся ближе к центру, чем ядра остальных клеток в розетке (Рис. 3B). Клетки в розетках окрашиваются на нестин. Розетко-подобные структуры были обнаружены в нейросферах при длительном культивировании в течение 65-ти суток (Рис. 3C), при котором нейросферы тщательно разбивали до единичных клеток с использованием ферментативной диссоциации. Это указывает на возможность развития розеток из отдельных клеток.

Для более детального исследования дифференцировки и пролиферации клеток нейросферы осаждали на покровные стекла в среде с 10% ФСТ без факторов роста. В этих условиях нейросферы малых размеров (50-200 мкм), как правило, «распластываются», образуя практически монослой. У средних и крупных нейросфер (300-500 мкм и более) сохраняется плотное скопление клеток в центре в виде полусферы, а по краям мигрирующие от центра клетки формируют один или несколько слоев. И в том, и в другом случае клетки мигрируют в радиальном направлении от центра прикрепившейся нейросферы. Среди клеток прикрепленных нейросфер значительную популяцию составляют клетки, иммунопозитивные к нестину и виментину (Рис. 4). Одновременная окраска антителами против нестина и виментина «распластанных» нейросфер показала, что выявляемые при этом картины практически идентичны. Это указывает на то, что многие клетки имеют положительную реакцию на оба белка одновременно. Морфология этих клеток разнообразна. Помимо мигрирующих клеток биполярной формы, внутри и по краям адгезивных нейросфер можно обнаружить клетки с хорошо распластанной цитоплазмой.

Исследования дифференцировки клеток в адгезивных нейросферах проводили с использованием антител против β-тубулина III и ГФКБ (Рис. 5). Клетки с нейрональной дифференцировкой (нейробласты) имеют ярко выраженную морфологию, которая сильно отличается от клеток, окрашивающихся на нестин и/или виментин и ГФКБ. Среди β-тубулин III позитивных клеток встречаются клетки моно-, би- и мультиполярной формы. Форма ядра практически у всех нейробластов веретеновидная.­ Нужно отметить, что клетки, иммунопозитивные к β-тубулину III, никогда не прикреплялись непосредственно к покровному стеклу, а всегда располагались и распространяли свои отростки поверх клеток других фенотипов. Отростки нейробластов, часто оканчиваются конусом роста.

При окраске антителами против ГФКБ было выявлено, что клетки, иммунопозитивные к этому белку, в морфологическом отношении во многом сходны с нестин- и/или виментин-положительными клетками. Однако, в отличие от последних, они образуют более разреженную популяцию в «распластанных» нейросферах (Рис. 5А). Двойная окраска антителами против ГФКБ и виментина или нестина явно демонстрирует, что многие ГФКБ-позитивные клетки окрашиваются на маркеры стволовых и прогениторных клеток.

Исследование пролиферативной активности проводили с использованием антител против белка Ki67. Анализ показал, все без исключения адгезивные нейросферы содержали Ki67-положительные клетки. Однако соотношение количества Ki67-положительных и Ki67-отрицательных клеток варьировало между нейросферами. Кроме того, при наблюдении ядер, окрашенных люминесцентным красителем Hoechst 33342, на препаратах часто обнаруживались клетки в различных фазах митотического деления. Фигуры митозов можно было обнаружить в клетках, которые окрашиваются на нестин, виментин и ГФКБ (Рис. 6).

В проблеме получения характеристик клеток в культурах НСПК, выращенных из первичных суспензий диссоциированных клеток эмбрионального мозга, важным является вопрос о сохранении в процессе культивирования клеток ненейрального происхождения. Первыми кандидатами на контаминацию культур нейральных клеток являются фибробласты, поскольку их источником могут являться оболочки эмбрионального мозга. Положительной окраски на фибронектин не было выявлено как в свободноплавающих нейросферах, так и в осажденных нейросферах. В тоже время во всех адгезивных культурах, выращенных с самого начала в среде с ФСТ, выявляются клетки, окрашивающиеся на фибронектин, а также внеклеточный фибронектин (Рис. 7). Особенно показательны данные исследований культур клеток, которые были получены путем разделения первичной суспензии пополам и затем выращенные параллельно двумя способами. Это указывает на то, что при культивировании на бессывороточной среде с ростовыми факторами происходит элиминация фибробластов, которые присутствовали в начальной суспензии. При двойных окрасках антителами против фибронектина и нестина, фибронектина и виметина адгезивных клеточных культур было обнаружено, что, во-первых, все без исключения фибронектин-позитивные клетки имеют положительную реакцию на виментин, а, во-вторых, некоторые фибронектин-позитивные клетки окрашиваются на нестин.

В условиях поставленного эксперимента возможны два пути формирования нейросфер. Первый - агрегация диссоциированных клеток. Второй – развитие из отдельных клеток, потомки которых остаются тесно связанными между собой. Вне зависимости от происхождения нейросферы имеют гетерогенный состав. Они включают клетки, находящиеся на различных стадиях нейральной дифференцировки. Полученные здесь данные подтверждают многие другие исследования относительно характеристики свободноплавающих нейросфер (Suslov et al., 2002; Bez et al., 2003; Lobo et al., 2003). Клетки в нейросферах обладают пролиферативной активностью. Однако уровень этой активности сильно варьирует от нейросферы к нейросфере даже в пределах одной культуры. Исходя из этого, можно заключить, что клетки начальной суспензии, которые дали начало нейросферам, были гетерогенны. Эта гетерогенность может быть обусловлена, во-первых, их функциональным состоянием на момент посева, а, во-вторых, тем, как они впоследствии отвечали на факторы, которые оказывают влияние на клеточный цикл и способ деления. Это согласуется с предположениями, сделанными в других исследованиях (Tropepe et al., 1999; Suslov et al., 2002).

Клетки, обнаруженные в розетках по многим признакам: положительной окраске на нестин и характерной миграции ядер при митозе, сходны с нейроэпителиальными клетками. Розетко-подобные кластеры клеток могут формироваться с самого начала культивирования. Это указывает на то, что они могут возникать двумя путями: либо за счет замыкания фрагментов неокортекса, которые сохранились, не смотря на длительное пипетирование с трипсинизацией, либо в следствие самоагрегации диссоциированных клеток нейроэпителия. Способность диссоциированных клеток различного происхождения агрегировать in vitro с образованием гистотипических структур, в настоящее время, рассматривается как перспектива развития тканевой инженерии (Layer et al., 2002). Имеются результаты исследований на схожих объектах, таких, как культуры диссоциированных клеток фетальной сетчатки (Sheffield and Moscona, 1970) культуры эмбриональных стволовых клеток, направленных в нейральную дифференцировку (Chen et al., 2003, Ying Q.-L. et al., 2003) и переживающих эксплантатах неокортекса эмбрионов человека (Смирнов et al, 1996). Здесь также образовывались агрегаты сфероидальной формы, содержащие розетко-подобные структуры.

Осаждение свободноплавающих нейросфер на покровные стекла в среде с ФСТ позволило установить, какие маркеры нейральной дифференцировки клетки могут экспрессировать одновременно. При двойных окрасках было обнаружено, что в адгезивных нейросферах встречаются клетки, иммунопозитивные к нестину и/или виментину, нестину и/или ГФКБ, виментину и/или ГФКБ. Ранее было показано, что в ГФКБ-положительные глиальные клетки как зрелого, так и развивающегося мозга могут экспрессировать одновременно нестин и виментин (Eliasson et al., 1999; Whittemore et al., 1999; Messam et al., 2000, 2002). Одновременная экспрессия нестина или виментина ГФКБ-позитивными глиальными клетками, по-видимому, играет важную роль при определенных функциональных нагрузках, как, например, при реактивном глиозе вследствие травмы или нейродегенеративных заболеваний, а также в процессе дифференцировки глиальных клеток.

При осаждении нейросфер клетки радиально мигрируют по направлению от центра к периферии. Вследствие этого, клетки прикрепленных нейросфер имеют преимущественно биполярную форму с длинными отростками, направленными радиально. В тоже время, среди нестин-, виментин- и ГФКБ-позитивных клеток встречаются клетки с хорошо расплатанной цитоплазмой и короткими отростками. Клетки, окрашивающиеся антителами против β-тубулина III, имеют выраженную морфологию нейробластов.