Тақырып 2 – Өсімдік клеткаларын in vitro жағдайында өсіру әдістері
жүктеу/скачать 35.42 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Қоректік орталар Қоректік ортанын құрамына минералды тұздар, көмірсулар, витаминдер, фитогормондар, амин қышқылдары кіреді.
- Көмірсутегі
|
Тақырып 2 – ӨСІМДІК КЛЕТКАЛАРЫН IN VITRO ЖАҒДАЙЫНДА ӨСІРУ ӘДІСТЕРІ Клеткаларды өсіру үшін эксплантты, қоректі ортаны, ыдыстарды, құрал-саймандарды алдын ала залалсыздандыру қажет. Өсімдіктен эксплантты бөліп алуда және оны қоректік ортаға отырғызуды ламинар боксінде өткізеді. Бұл бокстің ішіне фильтрден өткізіліп, микроорганизмдерден тазартылған ауа беріліп тұрады. Әр түрлі тәсілмен залалсыздандырылған және дистилденген суда бірнеше мәрте жуылған объектілерден керекті ұлпалар бөлініп алынады. Оларды стерильденген қатты немесе сұйық ортаға отырғызылады. Стерильдеу үшін автоклавты қолданады. Сөйтіп, өсімдіктердің әр түрлі ұлпалары мен мүшелерін өсіруге болады. Оларды ойдағыдай өсіу үшін ең алдымен қолайлы қоректік орта керек. Өсімдіктердің әбір түрі, тіпті сол бір түрінің кез келген мүшелері мен ұлпалары жақсы өсу үшін белгілі қоректік ортаны талап етеді. Оның үстіне, каллус пайда болу үшін, оның өсуі үшін және каллуста морфогенез процесінің жүруіне түрткі жасау үшін қоректік ортаның құрамы өр жолы өзгеше болуы керек. Соған байланысты, әр ғалым өзі зерттейтін объектісіне қолайлы қоректік ортаны мұқият талдап дайындауға тырысады. Сондықтан, әр түрлі мақсатқа бейімделген қоректік орта рецептерінің саны жылдан жылға көбеюде. Қоректік орталар Қоректік ортанын құрамына минералды тұздар, көмірсулар, витаминдер, фитогормондар, амин қышқылдары кіреді. Клеткалар іп vitro жағдайында көмірсутегіне мұқтаж, себебі олар гетеротрофты қоректенеді. Көмірсутегі ретінде сахароза немесе глюкоза қосылады. Барлық қоректік орталардың негізі болатын минералды тұздардың қоспасы. Ол клеткаларды макро- және микроэлементтермен қамтамасыз етеді. Азот қоректік ортаға нитрат немесе аммоний түрінде қосылады, фосфор - фосфат түрінде, күкірт - сульфат түрінде, темір - хелат немесе әр түрлі тұздар түрінде қосылады. Сонымен қатар, қоректік орта құрамына калий, кальций, магний иондары, бірсыпыра элементтер: В, Мn, J, Zn, Сu, Мо, Со кіреді. Көптеген орталардың құрамында витаминдер бар. Олардың ішінде ең маңыздылары В тобына жатады: В - тиамин, В2 - рибофлавин, В6 - пиридоксин. Көп клеткалар сонымен қатар никотин, фолий, пантетон қышқылдарын, мезоинозитты қажет етеді. Клеткалардың өзінде витаминдер түзіледі, бірақ аз мөлшерде. Сондықтан, қоректік ортаға қосылған витаминдер метаболизм реакция-ларының тежелмей өтуіне ықпалын тигізіп, клеткалардың өсуіне әсер етеді. Барлық физиологиялық процестерді реттейтін фитогормондар болғандықтан, олар қоректік ортаның маңызды компоненттері. Клеткаларға бөліну және дифференциялану үшін әсіресе ауксин мен цитокинин қажет. Тек қана ісік клеткалары мен «қалыптасқан» ұлпалар гормондары жоқ ортада өсе алады. «Қалыптасқан» каллус клеткалары гормондарды қажет етпейді, олар гормондарға прототрофты келеді, себебі өздерің өздері қамтамасыз ете алады. Алғашқы каллусты шығару үшін және оны өсіру үшін мына ауксиндер пайдаланылады: (3-индолилсірке қышқылы (ИСҚ), (3-нафтилсірке қышқылы (НСҚ), 2,4-дихлорфеноксисірке қышқылы (2,4—Д). Ауксиннің табиғи түрі ИСҚ клеткаларда оңай тотықсызданады. Сондықтан оны ортаға көп мөлшерде қосады, немесе көбінесе жасанды түрлерінде (НСҚ 2,4-Д) қосады. Алғашқы каллус алу үшін әдетте ауксинның концентрациясы жоғары болу қажет. Кейін каллусты өсіру үшін ортадағы ауксин мөлшерін төмендетеді. Кинетин (6 фурфуриламинопурин) клеткалардың бөлінуіне өте қажет, міндетті түрде қоректік ортаға кіретін компонент болып есептеледі. Сондай-ақ, активтілігі жоғары цитокининдер қатарына БАП (6-бензиламинопурин) жатады. БАП кең пайдаланылады, көптеген қоректік ортаның құрамына кіреді. Бұдан басқа, қоректік ортада комплекстік органикалық қосындылар болады. Атап айтқанда, әр түрлі экстракттар (солодтан, ашытқыдан, картоптан, ісік ұлпаларынан, т.с.с.), шырындар (қайын, томат, апельсин), пісіп жетілмеген эндоспермдер (кокос жаңғағы, каштан, жүгері), казеин гидролизаты, амин қышқылдар қоспалары. Бұлардын арасында клеткалардың өсуіне ең жақсы ықпалын тигізген кейбір өсімдіктердің пісіп жетілмеген эндоспермдері, әсіресе «кокос сүті» деп аталатын кокос жаңғағының эндоспермі. Дегенмен, соңғы кездерде зерттеушілер мұндай қосындаларды көп пайдаланбайды. Себебі, олардың құрамында әсер ететін белгісіз заттар мол болғандықтан, жасалған тәжірибелердің нәтижесін талдау және оларды қайталау қиын. Өсімдіктер клеткаларының қатты не сұйық ортада жақсы өсуі үшін, оның рН көрсеткішінің маңызы өте зор. Табиғи жағдайында клетканың тіршілік әрекеттері сутегі иондарының қолайлы концентрациясында (рН 5,5 - 7,5) өтеді. Макромолекулалардың, ең алдымен ферменттердің құрылымы және активтілігі рН деңгейіне байланысты. Сонымен қатар, шамасы, рН қоректік ортаның компоненттерінің, әсіресе витаминдерінің тұрақтылығына және сіңімділігіне әсер етеді. рН төмен болғанда агар қатпайды, сондықтан рН керекті шамасына сілті немесе қышқылмен жеткізіледі. Өсімдіктер клеткалары қоректік ортаның бастапқы рН көрсеткіші 5 пен 6 арасында болғанда жақсы өседі. Казеин гидролизаты немесе ашытқы экстракты сияқты күрделі органикалық қоспалары бар қоректік ортаның рН көрсеткіші клеткалар өсе келе аз өзгереді. Ал мұндай қоспалар қосылмаған қоректік ортанын рН шамасы клеткалар өсу арқасында анағүрлым өзгереді. Бүл жағдайды әсіре-се суспензиямен жүмыс істегенде ескеру керек. Ортаны қатыру үшін агар-агар қолданылады. Агар-агар деген теңіз балдырларынан өндірілетін полисахаридтердің қоспасы. Оның құрамында басқа заттар да бар, сондықтан оны 4-6 сағат бойы суды жиі өзгертіп жуу керек. Клетка өсіруде бірінші табыстарға жеткен Р. Готре мен Ф. Уайт клеткаларды агар қосылған қоректік ортада өсіруді бастап еді. Таң қаларлық бір жағдай – қазірге шейін кейбір лабороторияларда 1938 жылы Р. Готре сәбіз тамыр жемісінен алған каллустары сақталып өсіріліп келеді. Каллус клеткалары әрбір 3-4 апта сайын жаңа қоректік ортаға көшіріліп отырса, олар шексіз ұзақ өсе береді. Қоректік ортаны таңдау өсімдіктің түріне және эксперименттің мақсатына байланысты. Әдебиетте керек информация табылмаған күнде, тәжірибені әдетінше кең қолданылатын, атап айтқанда Мурасиге мен Скугтың, Шенк – Хильдебрандтың, Гомборгтың, Уайттың, Хеллердің, Линсмайер – Скугтың қоректік орталарын пайдаланады. Одан кейін гормондар мен органикалық қосымшалардың концентрациясын іріктеп ала бастайды. Бірінші кестеде атап кеткен қоректік орталардың құрамы келтірілген. Бұл орталар даражарнақты және қосжарнақты өсімдіктердің әр алуан түрлерін іn vitro жағдайында өсіруге жарамды болып табылды. Қазіргі уақытта кейбір фирмалар Мурасиге – Скугтың, Уайт, Хеллер орталарын құрғақ ұнтақ түрінде шығарады. Дегенмен, мұндай дайын орталар тек қоректік ортаның құрамы өзгертілмейтін тәжірибелерде пайдаланылады. Әдетінше, ғалымдар жаңа объектімен жұмыс істей бастағанда, олар стандартты қоректік орталардың құрамын өзгертеді. Әсіресе органикалық компоненттердің жиынтығы мен концентрациясы жиі өзгертіледі. Қоректік ортаның құрамы өсімдікке үйлесімді болу үшін, оны іріктегенде математикалық жоспарлау әдісін қолдану орынды. Математикалық жоспарлау әдісі бір мезгілде ортадағы көп факторлардың әсерін зерттеуге мүмкіншілік береді. Аталған әдіс әр жеке фактордың әсерін сан тұрғысынан анықтау мен қатар, бірнеше факторлар арасындағы әрекеттестіктің барын белгілеп, оның ықпалын бағалауға мүмкіншілік береді. Сөйтіп, математикалық жоспарлау әдісі қоектік ортаның қайсы компоненттері клеткаларға жақсы әсер ететінін және сол факторларының ең қолайлы ара қатысын белгілеп береді. жүктеу/скачать 35.42 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|