Образовательная программа «6D060722- молекулярная и клеточная биология»

В качестве материала использованы нуклеотидные последовательности мРНК 54 генов человека (Homo sapiens Genome build 37.2.), которые были получены из GenBank (http: // www.ncbi.nlm.nih.gov). Нуклеотидные последовательности 787 межгенных микроРНК получены из базы данных miRBase (http: // www.mirbase.org). Для подтверждения происхождения межгенных микроРНК была разработана программа miRNA Finder 2.2 (http: // sites.google.com/site/malaheenee/software/mirna-finder), которая определяла локализацию гена на хромосоме.

Для классификации генов по функциям и их роли в развитии РТК была использована он-лайн программа DAVID Bioinformatics Resources 6.7, NIAID/NIH (http: // niaid.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp). Программа работает на основе идентификационных кодов разных баз данных, мы использовали Refseq_мРНК коды. Для генов с несколькими альтернативными вариантами использовали самый длинный вариант (в основном первый транскрипт). На основе информации таких баз данных как NCBI, PIR and Uniprot/SwissProt, BioCarta & KEGG pathway гены были классифицированы по функциям.

3. 
   Поиск сайтов взаимодействия микроРНК с мРНК и описания их характеристик
   

Для расчета параметра ΔG/ΔG_m (%) или введенного нами score была использована следующая формула (1)

Сайты взаимодействия микроРНК с мРНК определяли на основании величины ΔG/ΔG_m и ее стандартного отклонения (p<0,0005). Пороговая величину ΔG/ΔG_m зависит от длины микроРНК (таблица 8). Сродство ig-miRNA к 5'UTR, CDS и 3'UTR мРНК 54 изученных генов оценивали для каждого из этих участков с достоверностью p<0,0005. Плотность сайтов связывания в 5'UTR, CDS, 3'UTR и всей мРНК рассчитывали как отношение числа сайтов (s) к длине нуклеотидной последовательности (l) этих участков умноженное на 10³ (s/l), то есть в расчете на 1000 нуклеотидов.

Таблица 8 – Значения ΔG/ΔG_m для микроРНК разной длины

Длина микроРНК	ΔG/ΔGm, %	Длина микроРНК	ΔG/ΔGm, %
27	70	21	76
26	71	20	77
25	72	19	78
24	73	18	80
23	74	17	82,5
22	75	16	85

Для описания характеристик сайтов были построены 2D структуры мРНК 13 генов мишеней микроРНК (ABCC2, ABCG2, ALCAM, APC, AXIN1, BAX, CDH1, FLCN, MLH3, MMP2, PTPN12, SRC, TP53) с помощью программы UNAFold.3.7 (http://dinamelt.bioinfo.rpi.edu). С помощью графической программы GNU Image Manipulation были построены сайты микроРНК.

Сайты, предсказанные программой TargetScan, были получены с базы данных (www.targetscan.org) от июня 2012. В этой последней версии TargetScan введены сайты связывания для всех подтвержденных микроРНК (miRBase Release 17). Также в этой версии базы есть сайты микроРНК для пяти орзанизмов (человек, мышь, нематода, дрозофила, рыба). С прошлого года в базе можно найти все канонические виды сайтов (5’-доминантный канонический сайт, сайт с 5’-доминантной seed областью и 3’-компенсаторный сайт) в генах мишенях микроРНК. Для изучения консервативности предсказанных сайтов микроРНК были скачены выравненные последовательности 3'UTR для семи сайтов (CCND1:hsa-miR-4487, GSK3B:hsa-miR-4710, GSK3B:hsa-miR-4732-3p, MTHFR:hsa-miR-1260, PTPN12:hsa-miR-4711-3p, TP53:hsa-miR-1285, ZEB1:hsa-miR-4663). Консервативность сайтов связывания изучена для следующих организмов: hsa – Homo sapiens (человек), mml – Macaca mulatta (макака-резус), ptr - Pаn troglodytes (шимпанзе), ocu – Oryctolagus cuniculus (кролик), oga – Otolemur garnetti (галаго).

Для поиска сайтов программой miRanda были использована версия miRanda v3.3a. Для удобства использования программы был использован скрипт emiRanda (разработанной В.А. Хайленко). Для сравнения были изучены мРНК 14 генов мишеней (ABCC2, APC, AXIN1, BAD, DLC1, FLCN, FZD7, KIT, KLF12, MET, MLH1, MLH3, MMP2, MMP9). Cайтов предсказанных программой miRanda представлены в базе www.microrna.org. Для проверки доступности сайтов предсказанных этой программой для 11 сайтов локализованных в 3'UTR, представленных в таблице 15 был проведен поиск по базе данных www.microrna.org, потому что в базе преставлены только сайты разположенные в 3'UTR области мРНК.

Нуклеотидные последовательности hsa-miR-1279, hsa-miR-548m получены из базы miRBase (http://www.mirbase.org). Свободная энергия гибридизации (ΔG) рассчитывалась с помощью программы RNAHybrid 2.1 (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/). Величина ΔG/ΔG_m (%) является сравнительным количественным критерием силы взаимодействия микроРНК с мРНК. ΔG_m равна энергии связи микроРНК с полностью комплементарной ей нуклеотидной последовательностью. Величины ΔG_m для hsa-miR-1279 и hsa-miR-548m соответственно равны -28,2 kcal/mol, -33,3 kcal/mol. Величину ΔG и ее стандартное отклонение использовали для определения по критерию Стьюдента уровня достоверности сайтов взаимодействия микроРНК с мРНК. Графики вариабельности нуклеотидных и аминокислотных последовательностей построены по программе WebLogo (http://weblogo.berkeley.edu/).

На первом этапе работы по литературным данным был проведен поиск генов с наличием мутаций при раке толстой кишки и составлена база генов из 142 генов, в которых экспериментально были обнаружены мутации при этом заболевании. Таблица А.1 (Приложение А) представляет все гены, которые мы ассоциировали с развитием рака толстой кишки.

Из 142 генов для дальнейшего исследования были отобраны 54 гена, которые наиболее важны и часто встречаются в опухоли этой локализации, то есть наибольшее количество исследований приходилось на эти гены. В таблице 9 представлены 54 гена и их характеристики. В таблице 9 указаны ссылки на работы, в которых были обнаружены нарушения и мутации в этих генах. В результате анализа литературы можно сделать вывод, что ключевую роль в развитии онкогенеза играют активирующие мутации в протоонкогенах и инактивирующие мутации в к генах супрессорах опухоли. Из 54 генов 9 генов относятся к протоонкогенам и 12 генам супрессорам опухоли. Все остальные гены участвуют в ключевых путях развития и малигнизации опухоли. Используя он-лайн программу DAVID Bioinformatics Resources 6.7, NIAID/NIH (http: // niaid.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) 54 гена были классифицированы в зависимости от функции гена.

Анализ литературы показал, что Wnt-сигнальный путь - основной путь активации пролиферации стволовых клеток кишечника, которые отвечают за постоянное самообновление эпителия кишечника. APC, AXIN1, AXIN2, CTNNB1, FZD7, GSK3B гены - участники Wnt-сигнального пути. Wnt-сигнальный путь играет ключевую роль в процессах регуляции дифференцировки и плюрипотентности стволовых клеток. Особо надо отметить APC ген, наследственные мутации в разных позициях этого гена вызывают развитие разных синдромов с высоким риском развития рака в течении всей жизни (таблица 1). Ген CTNNB1 кодирует β-катенин, за уровень этого белка отвечают участники Wnt-сигнального пути. Активация Wnt-сигнального пути осуществляется за счет семи трансмембранных белков семейства Frizzled, ген FZD7 является одним из представителей этого семейства. Активация рецептора приводит к фосфорилированию цитоплазматического хвоста белка Lrp6 или Lrp5, который после активации связывает мульти-протеиновый комплекс, состоящий из APC, Axin, GSK3 белков. Без стимуляции рецептора этот комплекс отвечает за инактивацию β-катенина. При активации рецептора происходит ингибирование комплекса и активируется β-катенин, стимулируется его проникновение в ядро. В ядре белок связывается с белками семейства LEF/TCF, отвечает за транскрипционную активность генов мишеней [245-250].

Гены MLH1, MLH3, MSH2, MSH3, MSH6, MUTYH, PMS1, PMS2 участвуют ДНК репарации и наследственные мутации в этих генах могут быть причиной

развитии наследственного неполипозного колоректального рака, которые обусловлены двумя наследственными синдромами (синдром Линча или MUTYH-ассоцированный полипозный синдром) [251-257].

Продолжение таблицы 9

Продолжение таблицы 9

Гены BAD, BAX, BUB1, PTEN, TP53, TNFSF10 относятся к генам, ответственных за активацию апоптоза. Мутации в этих генах часто встречаются при всех видах рака [258-263].

Гены клеточной адгезии и трансмембранных белков ADAM29, ALCAM, CDH1, EPCAM экспрессируются в клетках толстой кишки и отвечают за межклеточное и клетка-мартикс взаимодействия. Мутации во всех генах часто встречаются при карциноме толстой кишки, EPCAM считается карцинома-ассоциированным антигеном. CDH1 кодирует адгезивную молекулу Е-кадгерина, потеря которого приводит к активации матричных протеаз, которые расщепляют базальную ламину и приводит к подвижности клетки, активации процессов инвазивности. Антиген PROM1 или CD133 также относится к трансмембранным белкам, который экспрессируется на стволовых клетках толстой кишки и является одним из основных маркеров для определения этих клеток [266-270].

Гены BRAF, EGFR, KRAS, MYC [271-274] являются протоонкогенами и классифицированы как гены MAP киназного пути, потому что путь активирует mitogen-activated protein киназы. Анализ литературы показал, что активация этого сигнального пути свойственна для множества случаев РТК. Также этот путь называют Ras сигнальный путь, активация которого приводит к бесконтрольному росту клетки.

Мутации генов MMP2, MMP9 характерны для поздних стадий РТК с регионарными и отдаленными метастазами, так как эти гены кодируют металопротеиназы, которые участвуют в метазстазировании и инвазивности опухоли [275, 276].

Гены ABCB1, ABCC2, ABCG2 экспрессируется в стволовых раковых клетках и стволовых клетках. Гены обеспечивают множественную лекарственную устойчивость, потому что уменьшают аккумуляцию лекарств в клетках по средствам выкачивания их из клетки [277-279].

Гены с содержанием цинковых пальцев составляют следующую группу генов (KLF12, ZEB1, SNAI1, VDR) [280-283]. Эти гены имеют разнообразные функции, от транскрипционных факторов до регуляторов транскрипции. Мутации во всех генах были ассоциированы с РТК. Можно особо отметить ген VDR. По последним данным витамин Д является антагонистом РТК предположительно за счет ингибирования β-катенина. Предполагается, что β-катенин непосредственно взаимодействует с рецептором к витамину Д продуктом гена VDR.

Гены CD44, MET, KIT, SRC [284-287] относится к генам, ответственным за клеточную миграцию. Хотя многие гены участвуют и в других важных процессах. CD44 высоко экспрессируется у раковых стволовых клеток. Остальные гены относятся к протоонкогенам, активирующая мутация которых была зарегистрирована при РТК. KIT кодирует рецептор, активация которого отвечает за пролиферацию, ингибирование апоптоза при нехватке ростовых стимулов или гамма излучении. Ген SRC кодирует нерецепторную тирозин киназу, которая участвует в процессах клеточного деления, миграции, адгезии, клеточного выживания. Ген MET кодирует тирозин киназный рецептор, активация которого влияет на клеточную пролиферацию, выживание, подвижность, дифференцировку, морфогенез, при раке этот путь активируется на стадиях инвазивности и метастазирования опухоли. Все три киназы являются мишенями в разработке лекарств против рака.

Гены ENG, TGFBR2, VEGFA [288-290] имеют прямое или косвенное действие на стимуляцию роста сосудов. Первые два гена являются рецепторами к трансформирующему ростовому фактору бета – цитокину, который стимулирует рост сосудов в опухоли и ингибирует иммунные ответ. Третий ген кодирует фактор, активирующий рост сосудов, который также играет ключевую роль в разрастании и прогрессировании опухоли.

Последние семь генов имеют разные функции (PIK3CA, SMAD4, FLCN, DLC1, PTPN12, GNAS, MTHFR), участвуют в таких процессах как регуляции роста клеток и изменения цитоскелета и др. [291-297].

Результаты исследования были опубликованы в нескольких публикациях [298, 299].